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圣诞节的时候写东西是一种考验啊。最近三周补了两个实验，都是和图像处理相关的。幸好，结果都还不错。所以要感谢谭老师的鼎力相助。有一个实验做了三次， 第三次本来要重做的，但是deadline太近了，就取了第一次的结果，截取了单个细胞做的，结果还不错。另外一个实验，也是比较曲折的。第一次铺细胞的时候，用了一瓶很久之前的PBS，结果细胞污染了，所以东西需要现灭现用。第二次因为没有了做confocal的dish，在深夜十一点到处借，所以要感谢两个小师妹的雪中送炭，最后终于搞定。第二天又临时找了谭老师帮我拍照片，做三维重建，总之小插曲很多，但所幸最后还是做成了，结果也还不错。 我这个人向来运气还比较好，这次虽然惊险通关，但是以后还需要更好的准备。
下面给大家看看我的三维重建的图片。因为在word文档中，放不了动画，所以大家将就看看图片吧。
 三维重建这周要开始分享组织的免疫荧光方法了，说实话我的内心是非常怵的，因为没有做过几次。我希望可以把我有限的知识放在这里，抛砖引玉，引起大家的讨论，然后有更好的解决办法。 组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。这次主要讲组织的免疫荧光。 做组织的免疫荧光我做过的和知道的有两种方法，一种是选用冰冻切片的组织，一种是选用石蜡包埋的组织。两种方法各有优缺点。
 所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片样品中的抗原表位，从而大大改善免疫荧光染色。
在正式做荧光之前，片子的准备程序如下。（蓝色为石蜡切片，紫色为冰冻切片）
 石蜡切片冰冻切片1.4%多聚甲醛冰上固定2小时； 2.1xPBS洗一次，5min； 3.30%蔗糖沉降2小时； 4.OCT包埋。
组织和细胞一样有些常用的固定液。根据Bencroft的分类法，可分为四类： Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。 Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。
最常使用的是甲醛和多聚甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到，做比如电镜的固定剂一般用2.5%戊二醛固定。
而对于常用的甲醛及多聚甲醛固定液，各个的优缺点还是有些不一样的。10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。但经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。 4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
我自己做的比较多的是石蜡切片的。先给大家看看我们课题组做的石蜡切片的肺组织免疫荧光。
下面是石蜡切片的免疫荧光步骤 （左边为切片机，右边为漂片机）1.先检查切片机各部位是否已固定，刀片是否锋利（最好用新的刀片） 2.切片时要注意速度，太快易出现褶皱，这里可以先将样品置于冰上冷却哈； 3.切片时发现纵向刀痕时要停止切片，清除刀片上的那些碎屑； 4.展片水温控制在42℃左右，过高蜡片弥散，过低蜡片不能展开； 5.新换的水需要先将水加热到42度才能放入切片，否则水温上升后易出现微小气泡，影响贴片； 6.展片槽水位应较高，防止玻片触底带起气泡，贴附于蜡片下影响贴片； 7.展片时间要适中，过短则蜡片不能完全展开，过长则蜡片弥散，不利于贴片； 8.可用普通载玻片展片； 9.切片样品置于切片盒中敞开晾干后室温保存一段时间，我最长是两个月。建议长期保存还是放入蜡块中。
因为最近没有做相关的实验，所以没有拍图片，下次做的时候补上。 10.抗原修复：将切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸橼酸液修复液中，微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟（直接煮沸6分钟×4次）。 11.PBS浸洗2分钟X2次后，加0.2%tritonX-100透膜15分钟（如果你切片比较薄的话，也可不透膜，反正细胞已经被切开）。但如果是做细胞膜表面的蛋白，那就不要透膜了。 12.PBS 2分钟清洗2次。 13.用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（最好选用二抗同来源的血清，二抗一般来自山羊，所以可以选用山羊血清。）在湿盒中室温封闭1h。 14.用滤纸擦去封闭液，PBS清洗两次。 15.滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜。 16.滤纸吸去一抗，或者回收一抗。 17.PBS 3分钟×5次，用滤纸擦去标本外的PBS。 18.滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，此时可在荧光显微镜下迅速观察是否染上，以确定终止时间。 19.用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。 20.滴加 DAPI避光孵育15分钟。 21.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。 22.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
冰冻切片 冰冻切片机注意事项： 1.样品提前两小时从液氮中放在-20℃平衡样品温度； 2.冰冻包埋OCT液于室温呈液态，-15℃以下呈固态，如不马上切片，保存于-80度冰箱待用； 3.载玻片应置于室温，若长时间置于-20℃则组织将不能贴附; 4.切片：切片厚度40um，切片直接放在室温的PBS中，OCT会自动溶解于PBS中； 5.封闭过氧化物酶体：3%H2O2，（1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇）； 6.PBS 5分钟X3次； 7.高温抗原修复：95度水浴，柠檬酸盐（PH=6.0）修复液，6min。结束后放置20-30min使温度降低；（此步骤可选用，有相熟的同学做的时候用了这一步，结果也挺好的）； 8.PBS 5分钟X3次； 9.透膜，0.2%Triton 室温20 分钟； 10.封闭：10%山羊血清，1h； 11.一抗孵育4度过夜； 12.PBS 5分钟X3次； 13.孵育二抗，室温1h； 14.PBS 5分钟X3次； 15.滴加 DAPI避光孵育15分钟。 16.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。 17.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
今天就讲到这里了，谢谢大家。
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