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（本文作者：石河子大学药学院 周露等）
真菌感染一般分为两大类:浅部真菌感染和深部真菌感染。浅部真菌感染通常是由各种皮肤癣菌引起,主要侵犯皮肤、毛发、指甲等;而深部感染通常由白念珠菌、新生隐球菌、粗球孢子菌等引起,主要侵犯内脏器官和深部组织,危害性很大,常可危及生命。近年来,随着广谱抗菌药物和免疫抑制药的大量使用,以及肿瘤化疗、器官移植和艾滋病(AIDS)的出现,产生免疫抑制的个体不断增多,使真菌感染的发病率呈上升趋势,耐药现象增多,真菌感染日益引起人们关注。因此,研究抗真菌药的作用和耐药机制有利于研发更加安全、高效、低毒的药物。
1 作用于真菌细胞壁的药物
真菌细胞壁是真菌与周围环境的分界面,能控制细胞内的膨胀压力,保持菌体的完整性,若细胞壁破坏,则导致菌体溶解死亡。真菌细胞壁成分包括:几丁质、β2(1, 3) 2D2葡聚糖和甘露糖蛋白。通过抑制细胞壁组分的合成或破坏其结构,可以达到抑制、杀灭真菌的目的。由于哺乳动物细胞中不存在这些成分,因此,真菌细胞壁抑制药具有特有的选择性优势。
1. 1 几丁质合酶抑制药
代表药物尼可霉素(nikkomycin)和多氧霉素(polyoxins) 等,它们是通过抑制Chs2 和Chs3 合成酶,干扰几丁质的形成,致细胞壁缺失,达到抑菌效果。几丁质是β2( 1, 4)键连接的N2乙酰葡萄糖胺(N2GlcNAc)的同质多聚体,是细胞的支架结构。从营养生长到两项型到产生孢子,细胞壁中几丁质的含量及分布都在发生变化,其合成受细胞周期的调节。在几丁质合成过程中,受一些调节亚基控制, Chsl(csh1编码)修复细胞分裂造成的芽痕及初生隔膜的损伤, Chs2 (csh2编码)用于初生隔膜中几丁质的合成, Chs3 (csh3编码)合成孢子壁中的脱乙酰几丁质及芽痕和两侧细胞壁中90%几丁质。
1. 2 β2(1, 3) 2D2葡聚糖合酶抑制药
这类药物以棘球白素类和pneumocandin类为主要代表,其使真菌细胞壁增厚形成假菌丝,出芽不能与母细胞分离;细胞对渗透压调节作用下降,细胞溶解死亡。目前棘球白素类药物已有2 个品种上市, 即卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin) 。其中卡泊芬净是通过fsk1和fsk2这两种基因的作用发挥其对葡聚糖合成酶的抑制作用。真菌细胞壁的β2葡聚糖是由(1, 3)键和(1, 6)键连接而成的,因为(1, 3)聚糖所占比例大,抑制(1, 3)聚糖合成酶,就可导致胞壁结构破坏,细胞死亡。β2(1, 3) 2D 2葡聚糖由β2( 1, 3) 2D2葡聚糖合酶( glu2can svnthase, GS)催化合成, GS是由fsk1和fsk2两个基因共同编码。
1. 3 甘露糖蛋白抑制药
代表药物普那米星(pradimicin)和贝那诺米星(benamomicin)类药物通过钙离子(Ca2 + )与真菌细胞壁上的甘露聚糖和甘露聚糖复合物桥连,使甘露聚糖空间结构发生改变,从而引起细胞壁破裂,细胞膜通透性增加,导致细胞死亡。甘露糖蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GP I)附着到质膜上或由β2(1, 6)键连接到葡聚糖或几丁质的网状结构中,在真菌的细胞周期中发挥重要的作用。甘露聚糖主要是通过N2乙酰2葡糖胺残基上的β2(1, 4)二糖共价地连接在蛋白质上形成甘露聚糖蛋白复合物。
2 作用于真菌细胞膜的药物
真菌细胞膜是一种渗透屏障,含有固醇、鞘脂、蛋白质成分,分别决定细胞膜的刚性、流动性及转运功能。目前,干扰真菌细胞膜是临床常用抗真菌药的主要作用机制,很多药物都是通过作用膜的成分或相关的酶来达到抑菌或杀菌作用。
2. 1 作用于麦角甾醇(ergosterol)的药物
2. 1. 1 直接和麦角甾醇结合,影响膜的稳定性
多烯类(polyenes)药物,如制霉菌素、两性霉素、那他霉素等,此类化合物通过一个内酯键成环,包含3～7个共轭双键(疏水部分)和很多羟基及一个海藻糖胺(亲水部分) 。这类药物的作用机制是: ①分子的疏水部分以范德华力与麦角甾醇结合,形成中空圆柱状甾醇2多烯复合物,破坏了细胞质膜的渗透性。膜结构改变越显著,以浓度梯度调节方式扩散到细胞中的微粒大小及数量增长越多。由于麦角甾醇C22上有双键,因此,整个分子构象有利于与多烯大环内酯作用,亲和力更大,药物对真菌的选择性更高; ②分子的亲水部分则在膜上形成水孔,导致细胞因电解质和基质外泄而死亡。而两性霉素B还能抑制质膜上的酶,通过膜脂过氧化导致细胞的氧化损坏。
2. 1. 2 影响麦角甾醇的合成
①烯丙胺类:代表药物有萘替芬(nafifine) 、特比萘芬(terbinafine) 、布替萘芬(butenafine)等。特比萘芬对某些丝状真菌(皮肤真菌、曲霉菌)和双相型真菌有良好体外活性,是真菌SE的可逆、非竞争性抑制剂。真菌与哺乳动物中SE的氨基酸序列的差异可能是萘替芬、特比萘芬选择性的分子基础。此类药物的侧链部分和酶的亲脂性位点结合,造成酶构象改变而失活,引起角鲨烯的积累和麦角固醇的缺乏。由于角鲨烯积累使细胞膜渗透性增加,导致真菌细胞死亡。目前,还没有发现人类致病真菌对烯丙胺类药物产生继发性耐药性,但谷类致病真菌Usti1agomaydisn能对烯丙胺类产生耐药性。②唑类:氮唑类抗真菌药物分为咪唑类和三唑类,咪唑包括咪康唑、酮康唑等; 三唑包括伊曲康唑、伏立康唑等。唑类药物可与真菌细胞内P450分子中亚铁血红素上的亚铁离子络合,从而抑制P450羟化酶催化的羊毛甾醇脱14α2甲基化反应,使羊毛甾醇到麦角甾醇的转化受阻,导致真菌膜通透性以及连接在膜上的许多酶活性发生相应的改变,达到抑菌或杀菌作用。
2. 2 作用于鞘磷脂(sphingolipid)
鞘磷脂在真菌和哺乳动物间存在很大的差异,是较有开发价值的抗真菌药物的靶位。许多药物是通过抑制鞘磷脂的合成过程所需的酶来抑菌、杀菌。天然抑制剂鞘氨醇菌素、脂黄菌素及绿啶素等可抑制真菌细胞鞘脂合成第一步的催化酶丝氨酸软脂酰转移酶。烟曲霉素可抑制第二步所需的神经鞘氨醇N2乙酰转移酶,在体外对白念珠菌有抑制作用,在体内的作用相对较弱。铁锈霉素、短柄霉素等可抑制真菌特有的肌醇磷酸神经酰胺(IPC)合成酶,导致鞘类磷脂排空和神经酰胺积聚,破坏胞膜和微观结构而死。
3 影响DNA和蛋白质合成的药物
3. 1 作用于DNA 拓扑异构酶
DNA 拓扑异构酶(DNA topoisomerase, TOPO)能改变DNA 的拓扑化学结构,改变DNA 的超螺旋水平,还可以将几个环状DNA连接起来。DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ是原核和真核细胞内普遍存在的酶,酶活性的抑制可稳定拓扑异构酶2DNA复合体,导致翻译和复制受到抑制,最终阻碍DNA合成和细胞分裂,造成细胞死亡。而致病真菌有较高水平的DNA异构酶Ⅰ和Ⅱ,故可成为研制抗真菌药物新的作用靶位。体外喜树碱及其衍生物可有效抑制新生隐球菌拓扑异构酶Ⅰ的活性,拓扑异构酶Ⅱ抑制药依托泊苷对念珠菌有较弱的抗菌活性。
3. 2 抑制真菌蛋白质生物合成
延长因子(elongation factor, EF)是真菌和哺乳动物细胞中蛋白质生物合成所必需。粪壳菌素及其衍生物是选择性的EF抑制剂,作用于蛋白质的翻译过程,最近发现3种新型的粪壳菌素衍生物GM2211676、GM2237354、GM2193663,它们在小鼠网状内皮细胞真菌病模型中有非常好的体外抑制活性。从青霉菌Penicillium minioluteum和Crapbium putredinis代谢产物中分离的2种物质也具有类似功能,它们都可以稳定地结合EF2与核糖体的复合体,进而阻碍EF2 的释放,不能合成蛋白。
4 抑制核酸合成的药物
4. 1 干扰嘌呤代谢
灰黄霉素是早期的抗真菌药,其发现开创抗真菌抗生素的历史,因其结构与鸟嘌呤类似,可竞争性地抑制鸟嘌呤进入DNA分子,影响核酸合成。它作用于真菌后,使菌丝肿胀,细胞壁丧失其完整性,细胞质膜近乎消失,对于生长期的菌丝作用更强。
4. 2 干扰嘧啶代谢
52氟胞嘧啶(52FC)是目前临床比较常用的作用于核酸合成的抗真菌药物。其在渗透酶的帮助下进入真菌细胞,一旦进入胞内,则通过胞嘧啶脱氨酶转化成为氟尿嘧啶(52FU) 。随后通过鸟苷酸(UMP) 2焦磷酸酶转化为52氟鸟苷酸( FUMP) ,再进一步被磷酸化后掺入到RNA中,最终破坏蛋白质的合成。临床上, 52FC一般不会单独使用,与其他抗真菌药如氟康唑等联合应用。
5 作用于真菌线粒体的药物
以线粒体为作用靶点的抗真菌机制有2种方式:①抑制线粒体三磷腺苷(ATP)合成酶; ②抑制电子传递链。UK22A 和UK23A 是从链霉菌Strep tomyces sp中分离的一类具有双内酯结构的广谱抗真菌化合物,它们作用于真菌线粒体电子传递链Cytbcl复合物,抑制电子转移干扰线粒体的有氧呼吸, 引起细胞死亡。水蓼二醛为天然倍半萜二醛,可以抑制酿酒酵母线粒体ATP酶产生ATP,还破坏细胞膜,引起质子流入细胞,启动膜质子泵在ATP酶的参与下将胞内多余的质子泵出胞外,从而消耗大量的ATP,使细胞不能维持正常代谢而死亡。
6 抗真菌药物的真菌耐药机制
真菌耐药性的产生与细胞内药物积聚降低、药物作用靶位改变与过量表达、细胞壁成分的变化、膜甾醇合成通路的变化以及生物膜的形成等因素有关。不同种类药物作用机制不同,不同真菌对不同药物产生耐药性的机制也不相同。
6. 1 氮唑类
近年来研究酵母菌对唑类药物的耐药机制比较多,目前多数学者认为其耐药机制主要有3点: ①细胞膜甾醇类成分的改变导致唑类药物的通透性降低,细胞摄取和蓄积的药物量减少; ②唑类药物的靶酶CYP51基因分子水平的修饰,包括基因的突变、过度表达以及CYP51对药物亲和力的降低; ③ 唑类药物的靶酶CYP51过量表达。
6. 2 多烯类
两性霉素B和丙烯胺类的特比萘芬有强大的杀真菌作用,故很少产生耐药性,且其大部分耐药菌株为临床上少见的菌种,如光滑念珠菌。这可能是因为细胞膜中脂类的数量和质量在发生变化,特别是麦角固醇含量减少,降低两性霉素B与细胞膜结合的概率和真菌细胞对两性霉素B 引起的氧化现象敏感性降低。
6. 3 氟胞嘧啶
进入细胞的52FC减少(渗透酶失活)或负责将52FC转化为FUMP的酶失活是导致对52FC耐药的原因。大部分临床分离的白念珠菌和新型隐球菌对52FC耐药是由于发生突变,缺失胞嘧啶脱氨基酶或URTase。真菌细胞内由于缺少胞嘧啶脱氨酶或鸟苷磷酸核糖基转移酶时,使52FC不能转化为52FU,使抑制核酸合成的抗真菌药产生耐药,这种耐药性与胞嘧啶渗透酶缺陷所致的药物摄取减少有关。
7 结束语
近年来,抗真菌药物的研究取得了很大的进展,并已发现了一些新的作用靶点和新的结构类型的先导化合物,因此今后对于新型抗真菌药物的研究方向应致力于对已有化合物的优化。由于现在对作用于细胞膜和核酸的药物比较多,耐药性的发生率也在增加,故研究抗真菌药物的作用机制和细菌耐药机制有利于改善已有药物的特性或研发新的药物,以便更好的达到抑菌或杀菌效果。随着对药物的作用机制更深入的研究,相信通过结构修饰或新剂型的研发,可提高生物利用度,增加给药途径,降低成本,开拓新的抗真菌药的市场。
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