小麦DNA提取方法

5卷第4期
20O9年8月
阿方净阮学杯(自然科学版)
JournalofHebeiNorthUniversity(NaturalScienceEditi0n)
Vo1．25 N0．4
Aug．2OO9

田再民，龚学臣，季伟
(1．河北北方学院农林科技学院，河北张家口o750oO；2．北京市农林科学院，北京l0OO97)
摘要：目的用4种方法对小麦DNA进行提取，从中选取最好的方法，满足小麦材料进行分子标记的检
测．方法以小麦幼叶为材料，采用cTAB法l、cTAB法2、cTAB法3和Na0H法，提取小麦基因组
DNA．结果Na0H法提取DNA用时短，方法简单，但常有DNA样品扩增不出PcR产物的情况；CTAB法
提取的DNA质量较高，而且cTAB法3在省略了65℃温浴并将两次氯仿：异戊醇抽提改为一次抽提，缩短了
试验时间，降低了试验成本，提取的DNA可以满足实验需要．结论试验表明，用cTAB法3提取小麦
DNA，既缩短了时间又满足进行分子标记检测的需要．
关键词：小麦；DNA；提取；cTAB
中图分类号：Q943．2文献标识码：A文章编号：1673—1492(2OO9)O4—0022一O4
COm parisOn OfW heatDNA ExtractiOn M ethods
TIAN Zai—min，GONG Xue．chen，JIW ei
(1．CoUegeofAgricuItureandForesty，HebeiNorthUniversity，ZhangjiakouO75OO0，Hebei，China；
2．Be ingAcdemyofAgricu1turalandForestrySciences，Be ing 1O0O97，China)
Abstract：objective Tofindoutabetteronefrom f0urwheatDNA extractionmethodsforthemo—
lecularmarkeranalysisoflargequantitysamp1es．M ethods Thewheatleafletswereusedasexperimental
materia1sto study theDNA extracting methods including CTAB 1，CTAB 2，CTAB 3 and Nao H meth—
ods．ResuIts The Na()H m ethod wasvery simpIewith Iesstime，butitcouIdntproduce PCR．CTAB
m ethod reduced thecostandsaved timefortheexperiment，thequality ofDNA wasthebetter，CTAB 3
extractingmethodusedchloroform isoam y1alc0holextraction foroneinstead oftwotimeswithskipping 65
℃warm bath．Conclusion Theexperimentindicated thatCTAB 3extractingm ethod savedtimeandsat—
isfjedm0lecularmarkeranalysis．
Key wOrds：wheat；DNA；extract；CTAB
O前言
植物DNA提取是分子标记选择中最重要、最基本的操作．为了分离出高质量、高纯度的植物基因组
DNA，许多学者用SDs(十二烷基硫酸钠)、cTAB(十六烷基三乙基溴化铵)等方法以小麦、水稻、大
豆等作物的嫩叶为材料提取DNA，尽管分离的DNA质量、纯度都较高，符合PcR检测的要求，但此法
要用液氮冷冻，操作步骤复杂，影响了分子标记技术的普及和推广．不用液氮也可以直接从大豆、玉米、
小麦种子中提取DNA_l]．不用液氮从小麦、棉花叶片中提取DNA也有报道[6。]．在分子标记辅助选择
技术普及后，人们需要更简单、易行的提取DNA的方法．本研究在传统植物基因组DNA提取方法的基
础上综合了几种DNA提取方法的优点，探索了以小麦幼叶为材料快速提取DNA的方法，旨在为PCR扩
增和重要农艺性状基因的分子标记辅助选择育种提供可行的方法_l8]．
来稿日期：2009一O3—27
基金项目：国家“863”计划项目(2o06AA1001o2)；北京市农业育种基础研究创新平台项目(YzPTol～O4)
作者简介：田再民(1981一)，男，内蒙古赤峰人，河北北方学院农业科学系教师，硕士．8月田再民等：小麦DNA提取方法的比较第4期
1．材料与方法
1．1材料
小麦(Fu3北京市农林科学院提供)
1．2实验方法
用4种方法分别提取小麦幼苗叶片，方法如下：
1．2．1 CTAB法l(方法1)在1．5ml的离心管中加入6O0 LCTAB提取液(10gCTAB溶于纯水)，
加入5OmL 1mol／L的Tris—HCl，280mL2．5mol／L的NaC1，1OmLD—Mercaptoethanol和20mL O．5
mol／L的EDTA—Na，定容至5O0mL)，取种小麦幼苗叶片(2～3cm)放人缓冲液中，用金属棒捣碎，
在65℃水浴保温30min，加人60O L氯仿：异戊醇(体积比24：1)，充分摇匀后冰上放置10min，以
100oOr／min的速度在4℃下离心10min，将上清液转入另一离心管，加人与上清液等体积的氯仿：异戊
醇(体积比24：1)摇匀，以1OO00r／min的速度在4℃下离心10min，将上清液转入另一离心管，加入
与上清液等量异丙醇摇匀，在一2O℃下保存3Omin，以100OOr／min的速度在4℃下离心1Omin，小心
倒掉上清液，沉淀用70乙醇洗涤1次，每次高速离心3Os，倒掉乙醇，在室温下干燥DNA，加入1OO
LTE缓冲液，溶解DNA．
1．2．2 CTAB法2(方法2)本方法比方法1少一次氯仿和异戊醇抽提，其余与方法1相同．
1．2．3 cTAB法3(方法3)本方法比方法2省去了65℃水浴保温30min一步，其余与方法2相同．
1．2．4 NaoH法(方法4)将1．5ml的离心管放在冰上，加入0．25mol／L的NaoH溶液40 L，取幼
苗叶片约20mm放人其中，在沸水中放置3Os，从沸水中取出，放置至室温，向管中加入O．25mol／L
的Hcl溶液40 I，0．5mol／L的Tris—HCl溶液(加入O．25 SDS)20 L，充分混匀，在沸水中放置2
min，取出放置在一2O℃冰箱内保存_1．
1．2．5 DNA浓度和质量检测采用eppendorf核酸分析仪，以去离子水为对照，测定DNA样品的吸光
值()D。。、OD。、OD320、oD。0／2。和DNA浓度，根据()D 0／2。。评价DNA质量．配制O．8的琼脂糖凝
胶，取1 LDNA样品上样，12OV恒压电泳45min，在UVP凝胶成像仪上照相．
2结果
2．1 CTAB法与NaoH法的比较
CTAB法中，以CTAB法1为例，比较cTAB法1和NaoH法的不同．NaOH法用时短、方法简
单，但常有DNA样品扩增不出PcR产物的情况(如图1)．cTAB法1提取的DNA纯度高，色泽洁白，
用于SSR分析谱带清晰，重复性好．
与Na0H法相比，用CTAB法1所获得的DNA质量最
好，可保证PCR反应的正常进行．
2．2三种CTAB法的比较
由于CTAB法1的提取步骤多，整个过程所需时间较长．
为此将CTAB法1中的两次抽提改1次抽提作为CTAB法2，
再将省略65℃水浴保温的方法作为CTAB法3．比较3种
cTAB法，核酸中嘌呤、嘧啶中都有共扼双键，对紫外光有强
烈的吸收[“]，天然双链DNA在26Onm处的吸收值与280nm
l 2 3 4 5 6 7 8
图1 Na0H法和CTAB法1提取DNA
的PCR扩增结果(gwm155)
注：1—4：Na0H法提取DNA的PCR扩增结果；
5—8：cTAB法1提取DNA的PCR扩增结果
处吸收值之比(OD。／OD。)应在1．8左右，低于1．8说明制剂中蛋白质可能未除尽，高于1．8说明制
剂中有RNAl12]．OD锄值的也反应了制剂中蛋白质的去除情况，数值低说明蛋白质去除彻底，数值高说
明还含有蛋白质．因此可以根据OD。／OD8。比值和OD值评价DNA制剂的纯度．由于SSR分析对
DNA质量要求不高，即使含有RNA也不影响试验结果．
本研究采用的3种CTAB法都省略了去除RNA的环节，由于3种CTAB提取方法都省略去除RNA
的环节，所以DNA的oD。／OD。。均分布在1．9～2．1之间．但oD32。值在0．O04～0．014之间，说明蛋白
·
23·年8月河北北方学院学报(自然科学版)第4期
质去除得比较彻底(如表1)，DNA质量较好．琼脂糖凝胶电泳检测也得出同样的结果(图2)．3种方法
相比，CTAB法3缩短了试验时间，降低了试验成本，实用性更强(如表2)．
本试验比较了4种DNA提取方法(3种CTAB法和NaOH法)比较，NaOH法用时短、方法简单，
但常有DNA样品扩增不出PCR产物的情况；cTAB法提取的DNA质量较高，而且cTAB法3在省略了
表1 3种提取方法制备小麦幼苗叶片DNA检测结果(3O个样品的平均值)
65℃温浴并将两次氯仿：异戊醇抽提改
为一次抽提，缩短了试验时间，使试验成
本降低，提取的DNA完全可以满足实验
需要．依据本实验的结果在利用SsR标
记检测种子纯度时，采用CTAB法3提
取小麦种胚DNA作为PCR反应的模板
DNA是比较理想的．
随着生物技术、分子生物学的快速发
展，分子标记、克隆等技术的推广应用，
很多种DNA提取方法被发明出来，现有
提取方法主要有：CTAB法、高盐低pH
法、SDs法、核DNA的制备(Bick1e等
1977)、苯酚法、提取试剂盒的使用、用
Chele 1oO(一种树脂的商标)(Walsh
等，1991)制备[¨引．而应用ssR技术
检测种子纯度，要求DNA的提取方法应
具有简便、易行、快速、花费低等优点，
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll l2 13
图2 3种方法提取小麦幼苗叶片的DNA
注：1：DNA marker；2—5：cTAB法1提取的DNA样品；6—9；CTAB法2提
取的DNA样品；10一】3：cTAB法3提取的DNA样品
表2 3种方法提取小麦幼苗叶片DNA成本、耗时及DNA质量
注：*表示每人提取2。O份DNA所需时间
因此本实验比较了不同提取方法提取小麦基因组DNA，CTAB法能很好地去除糖类物质，而糖类物质对
PCR扩增有一定的影响，因此本实验使用了CTAB法；由于少量的RNA存在不影响SsR分子标记检测
的结果，因此本实验提取的DNA样品没有经过RNase处理．
3结论
4种DNA提取方法中，NaOH法用时短、方法简单，但常有DNA样品扩增不出PcR产物的情况；
CTAB法3提取DNA质量较好，提取时间短，且能够进行分子标记的检测．因此，CTAB法3提取小麦
种胚DNA比较适合品种纯度检测，值得推广和应用．
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[责任编辑：刘守义]
(上接第2l页)
直接回收率达98．26，效果理想．对于实际生产最后产生的废液，可集中采取活性炭吸附，达到回收彻
底的目的；对于操作过程中锑水解的问题，可调解酸度使之水解，沉淀分离可加以回收；本流程中用了硝
酸和盐酸，工业中大量使用对环境造成污染，可在实际工艺中采取稀弱碱淋洗吸收，回收利用．在设计本
流程时，已经考虑到固体与液体的比例1：2，这样就使得生产中使用的容器不致于太大，给操作带来不
便；进一步扩大试验，100Og阳极泥按照以上设计流程，提取Au8．4Og，回收率达97．2，用时4d．
其中第一步的分离花的时间比较长，抽滤分离装置有待改进．
4结论
本文用多种方法对铅阳极泥中金的浸取做了研究，并加以对比：NaCN是金矿开采中最常用的化学试
剂，但是由于阳极泥与矿石成份不同，阳极泥的化学组成更复杂．在对阳极泥的处理过程中，浸出率不高
是其最大的缺点，另外由于其剧毒性，对环境对人员都有着极大危害．硫脲浸取效果不理想．王水是实验
室最常用最理想的矿样的处理化学试剂．在对铅阳极泥的处理上也是非常理想的，对环境的污染通过工艺
流程的优化可以消除．本着投资少，效果好，周期短的原则，采用硝酸分解Ag，王水浸Au的工艺流程，
对于贵金属含量高的工业副产品铅阳极泥，从中提取金，是一种可行的方法．
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