干细胞的消化传代技术

一、贴壁细胞的消化
        常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。 ; ]1 K2 \4 G" T9 X: k, x9 o$ P
1、 酶消化法 6 Q: B+ B8 t, G! A$ [
        贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1）、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2）、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
        常用的消化酶有: 2 n- I) ?+ w$ V2 U2 p
        1）、胰酶 这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。 & M( a# ^- g  U$ O
        2）、胶原酶 这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下干细胞。这种方法作用温和，对干细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。

        胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一，如果配的比较标准，消化的时候就容易消化，反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下，如果干细胞下来的比较多了，这时可以连同CMF或PBS加上营养液一起传。营养液中有血清，胰酶遇到血清就会自动终止消化，但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
        对于容易消化的干细胞，加入PBS缓冲液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。

        在此介绍一种简单省事并且效果好、不损失干细胞的方法：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和并分瓶。

        这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对干细胞的活性损伤较大，并有部分干细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则干细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤干细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。

 

2、离子螯合剂 0 P$ k7 t( f  T1 v
        离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测干细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。

        1）、EDTA 用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度，它不能被中和。因此，消化下来的干细胞要洗一遍。 * j! \. H1 n1 k
        2）、商品化的无酶消化液 有些消化酶液对干细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

        对于较难消化的干细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打。或者是弃去培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃去大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有干细胞脱落。但大量使用EDTA对干细胞有损伤作用。也可以先用PBS把干细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在少量干细胞消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样干细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀。

        

3、物理法：直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来。 6 G/ F2 E+ v: Q
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4、冷冻法：

        此方法仅能用于细胞传代时无法使组织上的细胞脱落下来的情况。本方法的原理是因干细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对干细胞损伤小，不需要中止或洗干细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的干细胞。不足是干细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1）、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3）、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4）、按一定比例传代。

        消化时间和干细胞类型、消化液的消化能力、干细胞的密度等多种因素有关。干细胞消化过程要注意消化时间。一般养一种新的干细胞要摸索一下消化时间，掌握干细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与干细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待干细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若干细胞密度过大则消化后干细胞易成团。

        消化时间不应超过5分钟，否则对干细胞损害很大。消化液覆盖干细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷干细胞，当干细胞收缩，部分干细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上干细胞。 / C3 x( J4 ?$ k+ D; \
       在消化过程中经常出现细胞铺不开的问题，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。

 

二、 贴壁干细胞的传代扩增 
        贴壁干细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对干细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的干细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为： " p2 }' B& i% e, X$ P# |
      将长成致密单层干细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；
      加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；
      一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；   E7 E$ s4 a5 _! T3 `% s* F! I
      视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

 

 传代细胞培养注意事项：   r; o; c: `2 q% F! W8 B
        1.严格的无菌操作 .
        2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养干细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。