成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法及应用的制作方法 （专利）

专利名称：一种成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法及应用的制作方法 技术领域： 本发明属生物技术领域，一种涉及成年人，但并不只限于人，可能包括如小鼠、狗、猫、家兔等其它哺乳动物，皮肤成纤维细胞的分离和规模体外培养的方法。 背景技术： 真皮层的成纤维细胞(fibroblast)负责合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，是影响皮肤结构和最后外观的关键细胞，所以又被称为皮肤青春细胞。年轻的皮肤大量存在胶原蛋白III，这是一种有力，富弹性，纤维较少的胶原蛋白。成熟的细胞因为机能退化，会逐渐停止分裂并失去制造胶原蛋白III的能力，而成为纤维细胞。纤维细胞处于功能静止状态，只有在一定的条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞才又能再转变为成纤维细胞，恢复分裂增生。 真皮层是表皮的基础，由于真皮层结构的改变、会造成年轻和年老肌肤的明显的差异。随着年岁的增加，真皮层胶原蛋白与弹力纤维的生产逐渐减缓，真皮层变得脆弱，容易受到环境的破坏；结果，真皮层里的胶原蛋白和弹力纤维就更加稀少。最后皮肤变得透明或是变薄，胶原蛋白破损的后果是肌肤失去弹性，产生细纹和皱纹。 目前获得真皮成纤维细胞的方法大多为酶消化法，由于成人的成纤维细胞被包裹在脂肪细胞、表皮细胞和大量纤维中间，酶消化的温度和时间非常重要，温度不够或时间短，可能造成只能获得表皮细胞或一些少量的无活性的纤维细胞，消化时间过长或温度过高，则可造成大量细胞受损，出现大量细胞碎片，难以获得大量的、活力好的和比较纯净的成纤维细胞。 常用成纤维细胞的培养为节省成本通常采用牛血清作为必需的营养生长因子添加剂；目前一些牛血清的供应商处理血清的技术手段通常比较简单，只是所谓无菌采集，有些甚至都未经100nm除菌、除支原体过滤和钴60射线辐照；一旦出现类似疯牛病病原污染的血清来培养人的细胞，最终回输给人则后果不堪设想。另外，牛血清成分作为异性蛋白即使微量对于某些人亦可能造成过敏反应，特别是在多次注射后，更容易出现过敏、感染从而出现毁容问题。  发明内容 本发明的目的之一，克服目前单次酶消化法难以获得真正的成纤维细胞，多是表皮细胞及其它混合细胞的缺点，获取数量较多的，相对纯净的，可在短时间(4～6周)内规模培养达到治疗皮肤皱纹和瘢痕数量的成纤维细胞。 本发明的目的之二，克服细胞培养过程中可能遇到的其它动物血清的污染。 本发明的目的之三，克服细胞培养过程中可能遇到的其它动物血清蛋白污染造成的被注射者引起的过敏反应。 本发明为实现上述目的采取的技术方案包括以下步骤一种成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法，其特征在于以下步骤1.首先无菌从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入特制的保存液中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离。 保存液配方含1-20％人白蛋白，100u/ml青、链霉素的M199培养液2.将皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液洗液漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。 洗液配方含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)3.将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的4-16C消化6-24小时。 消化液配方一0.1-1％的胰酶，pH 7-9Hank’s液配制。 4.轻吸弃消化液，用无菌眼科镊剥离表皮与真皮层，将真皮层细胞转移至新孔，加入2ml新的消化酶(二)，37℃，消化30分钟～4小时。 消化液配方二0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)5.轻吸弃消化液，加入预冷的2ml生长液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37℃，5％CO2，(SANYO公司)静置培养。 生长液配方含1-20％人白蛋白M199培养液6.培养3-7天，待成纤维细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液(二)，37℃，消化10分钟。吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶(Nunc公司)，37℃，5％CO2，继续静置培养。 7.视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶。 8.待细胞总数扩至108，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗1次后，2～5ml消化液(二)，37℃，消化10分钟，吸弃消化液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗4次，重悬于2-4ml注射液中备用。 注射液配方107-8+5％人白蛋白溶液本发明由于采用两步消化法成功的解决了单次酶消化造成的产生的细胞种类混乱，成纤维细胞数量少，细胞活力差的问题；细胞多，贴壁生长呈典型的成纤维细胞的生长状态，细胞质向外伸出2-3个长短不一的突起，呈多角状或长梭形。 本发明由于采用正规生物药品人白蛋白制剂替代牛血清，因为其严格而可靠的灭菌灭病毒生产工艺，从根本上杜绝了可能的疯牛病病原污染；同时也解决了可能的过敏问题。 具体实施例方式 实施例11.首先由具有执业资格的医师在手术室无菌从一位40岁男性耳后取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入装有含1-20％人白蛋白，1％青、链霉素的M199培养液的液氮冻存管中，然后迅速放入预冻有冰的冰壶内，迅速(2小时)送交实验室分离。 2.在超静工作台内将皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织；然后用含1％青、链霉素的磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。 3.将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的0.1-2％的胰酶4-16C消化6-24小时。 4.轻吸弃消化液，用无菌眼科镊剥离表皮与真皮层，将真皮层细胞转移至新孔，无菌眼科剪剪碎并加入2ml新的0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37℃，消化30分钟～4小时。 5.轻吸弃消化液，加入预冷的2ml生长液(含1-20％人白蛋白M199培养液)，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37℃，5％CO2，培养过夜，弃孔内原液，换4ml新生长液继续培养。 6.培养7天，成纤维细胞生长铺满70％左右孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37℃，消化10分钟，。吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶，37℃，5％CO2，继续静置培养。 7.视情况3-4天换液一次，一周传代，每次一瓶传2-3瓶，传代种子细胞数控制在103-5个/ml为宜。 8.待细胞总数扩至108，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗1次后，0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37，消化10分钟，吸弃消化液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗4-6次，重悬于4ml 5％人白蛋白溶液中。 9.取该注射液0.1ml对原皮供者前臂内侧皮内注射观察30分钟，确认无红肿等过敏反应表现。 10.由专业皮肤科医师分两次进行眼角部位皱纹的局部多点注射。并进行适当医学处理。 11.观察3个月后，原细胞注射部位皱纹变浅，平复，无其它异常表现。 实施例21.首先用保险剃须刀对领取的BALB/C成年小鼠背部进行剃毛处理，拉颈处死小鼠，浸泡在75％酒精中消毒3分钟备用。 2.在超静工作台内无菌取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入50mm无菌塑料平内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织；然后用含1％青、链霉素的磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。 3.将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的0.1-2％的胰酶4-16C消化6-24小时。 4.轻吸弃消化液，用无菌眼科镊剥离表皮与真皮层，将真皮层细胞转移至新孔，无菌眼科剪剪碎并加入2ml新的0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37℃，消化30分钟～4小时。 5.轻吸弃消化液，加入预冷的2ml生长液(含1-20％人白蛋白M199培养液)，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37℃，5％CO2，培养过夜，弃孔内原液，换4ml新生长液继续培养。 6.培养7天，成纤维细胞生长铺满70％左右孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37℃，消化10分钟，。吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶，37℃，5％CO2，继续静置培养。 7.视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶，传代种子细胞数控制在103-5个/ml为宜。 待细胞总数扩至108，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗1次后，0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)混合液，37℃，消化10分钟，吸弃消化液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗4-6次，重悬于4ml 5％人白蛋白溶液中备用。 权利要求 1.一种成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法及应用，其特征在于以下步骤(1)首先无菌从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.3cm宽，1.0cm长的皮肤，放入特制的保存液中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离，保存液配方含1-20％人白蛋白，100u/ml青、链霉素的M199培养液；(2)将皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液洗液漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发，洗液配方含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)；(3)将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的4-16C消化6-24小时，消化液配方一0.1-1％的胰酶，pH 7-9Hank’s液配制；(4)轻吸弃消化液，用无菌眼科镊剥离表皮与真皮层，将真皮层细胞转移至新孔，加入2ml新的消化液(二)，37C，消化30分钟～4小时，消化液配方二0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)；(5)吸弃消化液，加入预冷的2ml生长液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37C，5％CO2，静置培养，生长液配方含1-20％人白蛋白M199培养液；(6)培养3-7天，待成纤维细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液(二)，37C，消化10分钟，吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶，37℃，5％CO2，继续静置培养；(7)视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶；(8)待细胞总数扩至108，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗1次后，2～5ml消化液(二)，37C，消化10分钟，吸弃消化液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗4次，重悬于2-4ml注射液中备用，注射液配方107-8+5％人白蛋白溶液；(9)采用以上分离培养的成纤维细胞可用于并不局限于皮肤除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及人工复合皮肤的制备。 全文摘要 本发明涉及一种分离与培养成人皮肤青春细胞的方法及应用，属于生物技术领域。本发明采用两步胰酶不同消化法成功的从成年人及动物体表皮肤中分离获得了纯净的真皮成纤维细胞并规模化培养，解决了由传统胰酶一步法消化造成的获得产生的细胞种类混乱，成纤维细胞数量少，细胞活力差的问题；可供皮肤美容除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及烧伤后人工复合皮肤的制备及其它目的所需。本发明采用了经严格而可靠的灭菌灭病毒处理的正规生物制品人白蛋白制剂替代常规动物血清培养细胞，克服了细胞培养过程中可能遇到的其它动物血清中的人兽共患病病原的污染；解决了由此造成的可能引起被注射者针对异种动物血清蛋白的过敏反应问题。 文档编号A61K35/36GK1891818SQ20051008267 公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月8日 优先权日2005年7月8日 发明者郑海发, 张永国 申请人:北京华特森基因科技有限公司。