【原】生动形象地说一下重叠延伸PCR（非常详细！0_o)

重叠延伸PCR本质上也是基本的PCR，不过引物不太一样。两片段可以互为引物，甚至可以将重叠延伸PCR的产物理解为“引物二聚体”。

第1步：PCR获得两个（图中AB和CB）或者多个片段，临近两个片段之间须有重叠区（图中红色区域）。产物可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。 第2步：以两个片段为例（图中A和B），AB的正链（B,上方）和CD的正链（D,下方）刚好可以在红色区域内匹配，匹配部分是3'端，有游离的-OH基团，可以延伸。AB的负链（B,下）和CD的负链（C,上）也可以在红色区域内匹配，但是末端是5’端，不能延伸。（直接的退火很关键，所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行，重叠区的Tm很关键，尽量设计得高一点，比如66~73℃，退火温度在61~68℃） 第3步：第2步产生的重叠产物，可用上下游引物进行PCR扩增过程。

实际操作注意点

引物设计：

重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。相连引物间的重叠区域以15-20个碱基为宜，重叠区域中应尽量避免富含 AT(ATTTA，AATAA、AATTAA等) 的序列，因为在片段合成过程中，接头区富含AT的区域极易发生错配。

Taq酶选择：

为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸 PCR 反应应避免使用普通 Taq酶，因为 Taq酶会在 PCR 产物末端加 A，从而可能会使产物移码突变。一般采用高保真 DNA 聚合酶。Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、Es Taq之类的，有3’— 5’的外切活性），如果第一步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。

热循环条件：

对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。反应的退火温度也要根据引物而定，在保证产物扩增效率的前提下，应尽量提高退火温度以提高产物的特异性，为下一轮PCR反应提供高质量的模板，从而降低反应的错配率。

重叠延伸PCR几个应用场景

1

引入定点突变

2

引入缺失

（图中引物空格只是为了显示引物比模板缺失几个部分碱基，实际引物上的两个脱氧核苷酸之间的距离是一样的）

3

引入插入片段

4

片段拼接(如不同结构域DNA片段拼接)

此外，该方法可用于长片段分段扩增，再重叠PCR拼接（5个片段以内的可以用同源重组酶进行连接，无需重叠PCR），也可以从基因组扩增出外显子，再拼接出完整的CDS区。