摘要：本文根据《中国湖泊富营养化调查规范》[1]等资料提供的操作方法，对水样预处理的情况、不同的提取时间、提取后不同的测量时间等几方面探讨了条件的变化对水中叶绿素a测定结果的影响，采用三色分光光度法来计算水中叶绿素a的含量。实验得出较佳的测量条件为：加入碳酸镁悬浮液处理水样；静置提取时间控制在16-20小时；提取后在10分钟内测定光密度等。
关键词：叶绿素a、分光光度法、藻类、浮游植物、提取液
一、 前言
随着污染的加剧，江河水富营养化越来越严重，藻类繁殖，使水厂净化时滤池过滤速率降低，影响水厂生产运作和自来水水质。因此，必须测定江河中藻类含量的情况，才能有效地指导生产。一般衡量水中浮游植物（藻类）现存量的方法很多，可以每升水中有多少个个体或细胞，或者用每升水中有多少毫克湿重、干重、叶绿素或其他指标来表示。前者称为浮游植物（藻类）的数量，后者称为浮游植物（藻类）的生物量。通常各门藻类都含有叶绿素a，它的测定比用计数法测定藻类的数量要简便和快速，目前已成为一个常用的测定藻类现存量的方法[2]。但是，由于叶绿素a的测定不象测定其他化学项目，可以通过标准及各种加标实验等衡量检测结果的准确性，在测定过程中，可能会因实验者对水样预处理情况、采用不同的提取液、不同的提取时间、提取后放置不同的时间后测定等因素造成提取率的不同而使实验结果有较大的差别。目前在供水行业对叶绿素a的测定中，少见文献报道关于这些影响因素的比对实验，为此，本文根据《中国湖泊富营养化调查规范》等资料提供的操作方法，对水样的预处理情况以及采用不同的提取时间、提取后不同的测定时间等几方面因素对分光光度法测定叶绿素a含量的测量条件进行比较，以寻找较佳的测量条件，取得较好的测定结果。其中，采用三色分光光度法来计算水中叶绿素a的含量。
二、 实验部分
2.1 试剂：
2.1.1 90%丙酮溶液；
2.1.2 1%碳酸镁悬浮液；
2.2 仪器设备及器皿：
2.2.1 紫外可见分光光度仪；
2.2.2 抽滤设备（包括真空泵、负压表、抽滤瓶等）；
2.2.3 台式离心机；
2.2.4 玻璃纤维滤膜（孔径0.4-0.8）；
2.2.5 组织细胞研磨器；
2.2.6 镊子；
2.2.7 剪子；
2.2.8 具塞刻度离心管（10mL）；
2.2.9 试管等；
2.3 实验步骤[1]及计算结果
2.3.1 水样采集及保存：
在水厂取水口处采集水样，每个体积为0.5L，低温保存至次日测量。
条件一：每升水样加1%碳酸镁悬浊液1mL[1]；
条件二：水样中不加1%碳酸镁悬浮液。
2.3.2 水样的浓缩：
装好抽滤装置，在抽滤器上装好醋酸纤维滤膜，过滤前在滤膜上加少量碳酸镁悬浮液，水样抽完后，继续抽1-2min。
2.3.3 提取：
抽滤完毕后，用镊子小心取下滤膜放在培养皿中，并放在冰箱中低温干燥(可保存几天)。然后将滤膜剪碎，放入细胞研磨器中，加入6-8mL90%丙酮，充分研磨后，将样品倒入具塞刻度离心管中，再用少量90%丙酮冲洗研磨器2-3次，倒入上述离心管中，使总体积小于10mL，盖上塞子。 摇动后放入冰箱中静置，静置提取时间分别为0、4、8、16、20h。
2.3.4 离心：
将上述处理好的装有样品的离心管放入离心机中，在3500-4000r/min转速下离心10-15min。将上清液移入具塞刻度离心管中，再加少量90%丙酮于原提取用的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，再将上清液并入已有上清液的具塞刻度离心管中，重复1-2次，直至沉淀物不含色素为止。最后将提取后的上清液定容到10mL。
2.3.5 光密度的测定：
将提取后的上清液倒入1cm光程的比色皿中，放入紫外可见分光光度仪中，分别放置0、5、10、20、30min后测量样品在750nm、663nm、645nm、630nm处相应的光密度值。
2.3.6 计算[3]：
以90%丙酮为空白，分别以663、645和630nm的光密度值减去750nm的光密度值即为各自波长（1cm光程）的校正光密度值表示为：OD663、OD645、OD630，按下式计算叶绿素a在90%丙酮中的含量（ug/L）：
叶绿素a(mg/L)=11.64(OD663)-2.16（OD645）+0.10（OD630）
将上式结果分别乘以提取液体积（10mL）即为过滤水中叶绿素a的量，再除以过滤水样的体积（0.5L）即得叶绿素a在水样体积单位的含量（ug/L）。
三、 实验结果与讨论
本文对西江河水进行实验，在水厂水源取水口处取样，进行以下的比对实验：
3.1 比对实验一：水样中是否加入稳定剂（1%碳酸镁悬浊液）对测定结果的影响
3.1.1按2.3.1（水样的采集与保存）的"条件一"，在水厂水源取水口处采集0.5升水样（A），每升水样加1%碳酸镁悬浊液1mL；另按照"条件二"，采集0.5升水样（B），中不加入1%碳酸镁悬浮液，并同时做平行样。
3.1.2 将A、B水样按上述2.3.2-2.3.6步骤进行处理，其中，在2.3.3（提取）中，选取的静置提取时间为20h；在2.3.5（光密度的测定）中，选取的测量时间为1min。
3.1.3 测定结果列于表1：
表1 加入稳定剂对测定结果的影响
样品名称 | 光密度值 | 测定结果
（ug/L） |
750.0nm | 663.0nm | 645.0nm | 630.0nm |
A-1 | 0.0218 | 0.0419 | 0.0375 | 0.0380 | 4.0334 |
A-2 | 0.0218 | 0.0418 | 0.0374 | 0.0381 | 4.0147 |
B-1 | -0.0004 | -0.0009 | -0.0007 | -0.0009 | 〈 0.1 |
B-2 | -0.0006 | -0.0011 | -0.0010 | -0.0012 | 〈 0.1 |
由以上结果看到，不加1%碳酸镁悬浊液的样品（B）的叶绿素a的含量小于检测下限，明显是色素已经溶解。由此可见，对于水样，如果无法马上测量，应加入1%碳酸镁悬浊液才能防止酸化引起色素溶解，并须放在冰箱中低温保存。
3.2 比对实验二：提取时间的长短对测量结果的影响
3.2.1 按2.3.1（样品采集与保存）的"条件一"进行水样采集和处理。
3.2.2 按2.3.2（水样的抽滤）对上述样品进行浓缩。然后进行提取，提取后分别按不同的静置时间0、4、8、16、20h 处理样品，得到5个样品。
3.2.3 对样品进行离心后，测量光密度，选取的测量时间为1min。
3.2.4 检测结果列于表2和图1：
表2 提取后静置时间对测定结果的影响
样品名称 | 光密度值 | 测定结果
（ug/L） |
750.0nm | 663.0nm | 645.0nm | 630.0nm |
0 | 0.0287 | 0.0324 | 0.0333 | 0.0337 | 0.6726 |
4 | 0.0160 | 0.0221 | 0.0228 | 0.0230 | 1.1403 |
8 | 0.0142 | 0.0285 | 0.0287 | 0.0293 | 2.7328 |
16 | 0.0094 | 0.0240 | 0.0153 | 0.0145 | 3.1540 |
20 | 0.0090 | 0.0238 | 0.0151 | 0.0143 | 3.1925 |
由以上检测结果可以看到，随着提取时间的增加，叶绿素a的测定结果有了较明显的增加，到了一定的时间才稳定。因此，为了能准确测定饮用水源水中叶绿素a的含量，必须严格控制好提取时间，以期充分把水中叶绿素a提取出来，使检测结果较为可靠。
3.3 比对实验三：提取后不同的测量时间间隔对检测结果的影响
3.3.1 按"条件一"进行水样的采集和保存，然后对水样进行抽滤（浓缩）；
3.3.2 提取时间选为20h，然后，通过"离心"收集提取液；
3.3.3 在"光密度的测定"时，分别在0、5、10、20、30min时测量样品在750nm、663nm、645nm、630nm处相应的光密度值。
3.3.4 检测结果列于表3和图2：
表3 测量时间间隔对测定结果的影响
样品名称 | 光密度值 | 测定结果
（ug/L） |
750.0nm | 663.0nm | 645.0nm | 630.0nm |
0 | 0.0118 | 0.0332 | 0.0225 | 0.0223 | 4.5407 |
5 | 0.0118 | 0.0333 | 0.0227 | 0.0223 | 4.5553 |
10 | 0.0120 | 0.0334 | 0.0230 | 0.0227 | 4.5281 |
20 | 0.0218 | 0.0419 | 0.0375 | 0.0380 | 4.0334 |
30 | 0.0194 | 0.0380 | 0.0385 | 0.0388 | 3.5438 |
由以上检测结果可以看到，在0-10min内测定得到的检测结果较稳定，20min时，检测结果稍微有一些偏差，但不是很大，但是，在30min时测定结果明显开始降低，偏差也较大，这可能是放置时间过长，引起色素分解所造成的。因此，在最后进行样品的光密度测定时，应把握好时间，在10分钟以内测定，以防止样品因色素分解而造成的检测结果偏低的现象。
四、 小结
根据以上的几组比对实验，利用分光光度法测定水中叶绿素a的含量时，应选择以下较佳的测量条件：
1、如果不是马上测量，水样需进行预处理，采集的水样加入碳酸镁（每升水样加1%碳酸镁悬浊液1mL[2]），以防止酸化引起色素溶解。
2、为了使色素得到充分的提取，提取时一方面要注意研磨充分，并冲洗几次研磨器；另一方面，要把提取时间控制在16-20小时内，这样才能保证较高的提取效率，但不应无限制的延长提取时间，以防色素分解。
3、在进行光密度测量时，在10min内迅速测量完毕，以防止色素分解，引起检测结果偏低等。
参考文献：
[1] 中国环境科学院，中国湖泊富营养化调查规范，P268-270
[2] 章宗涉等，淡水浮游生物研究方法，科学出版社，1991，P333，P345
[3] 天津市自来水集团有限公司，水质检验中心实施细则，P2-1
