核酸提取 测浓度 A260/A280

A260/A280是测核酸浓度和纯度用的。

用紫外分光光度计测量样品时,不同成分的样品会有不同的吸光度。

260纳米(nm)是核酸的最高吸收峰的吸收波长,280nm则是蛋白和酚类的。

纯DNA的A260/A280=1.8
纯RNA的A260/A280=2.0
当样品被蛋白质或者酚污染的话，A260/A280值会下降；

核酸最高吸收峰的吸收波长最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。

OD260/280比值指260nm和280nm下吸光光度比值。OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.9 <OD260/OD280<2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。一般认为，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间可以进入下面逆转录实验。当比值低于1.8时，考虑有蛋白质或酚污染；当比值高于2.0时，表明可能有异硫氰酸残存。 RNA 浓度即为 260 nm 处 OD 值所对应的浓度（单位为 µg/µl）。

提取RNA时分层现象：RNA提取时,加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA）,中间白色薄层（应该是蛋白和DNA）,下层有机相（氯仿和蛋白等）

RNA提取原则

1. 保持RNA分子结构的完整性

RNA提取条件较DNA严格，主要是因为样品及环境中，存在大量的RNase，而RNase较耐高温，不易失活，因此在提取RNA时，需要避免内外源RNase的污染，这是保证RNA成功提取的关键所在。

2. 尽量去除其他分子的污染

去除DNA、蛋白质、盐离子等杂质，保证核酸纯度。260/280在1.8-2.1之间，小于1.8有蛋白污染，大于2.2有RNA降解。260/230最佳2.0以上，小于2.0有盐类、有机溶剂等污染。

Trizol作用原理：

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

（未完）