在进行大多数RNA 分析之前, RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类:紫外(UV) 分光光度法,此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱; 基于荧光染料的方法,结合到核酸时选择性发荧光,测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的( 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染),用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。然而,如果样品中含有较多的杂质,或者如果RNA 的浓度非常低,最好使用荧光染料为基础的方法。有关分光光度法与荧光染料为基础的方法概述如表1 紫外吸收分光光度法 常规分光光度法 用于测定纯化的RNA 样品中的RNA 浓度,最常用的方法是在260nm 处测量其相对一个空白样品的吸光度(A260) ,即用于溶解RNA 的相同溶剂。A260 为1.0 对应40μg/mL 的单链RNA 。计算溶液中RNA浓度的公式如下: RNA 样品浓度(μg/mL) =A260 X 40 X 稀释倍数 这种方法需要的设备很少,通常包括:配备紫外灯的分光光度计和石英比色皿或特殊的能透射紫外线的塑料比色皿(测量核酸的吸光度所需的短波长被玻璃和一些塑料比色皿吸收) 。因为它快速简便、无损样品,所以吸收光谱法早已被用于测量纯的浓缩液中RNA的含量。该方法的准确度取决于几个因素。
微量分光光度计 除了灵敏度低,常规分光光度法的另一个局限性是其比色杯体积较大,如果想不损失一部分样品,很难对低浓度的RNA 进行定量。为了克服这些间题,后来开发出了微量分光光度法,这一方法可以高度精确并可重复地分析小体积样品( 0.5 ~ 2.0μL ) ,而且不需要比色皿、毛细管或其他样品器件。这样的仪器包括但不限于NanoDrop 分光光度计(Thermo Scientific ) 、NanoVue 分光光度计、Nano-Photometer UVNis 分光光度计( Implen ) 与Picodrop Microliter UV/Vis 分光光度计。这些仪器可以测量很大的波长范围(通常200~1 lOOnm ) ,因此可以用来测量RNA 、DNA 和蛋白质,某些清况下还可以测量染料(如花青素染料Cy3 和Cy5 标记的)。该仪器还可进行波长扫描以检测杂质;然后仪器软件将显示整个波长范围内的光谱, 计算A260 以及A260/A280 和A260/A230 的值。测量后样品可以用吸头轻松回收,或擦净样品板或清洁传感器。值得注意的是, Picodrop 可以通过吸头直接测量,从而没有污染并能完全回收样品。 这些工具中, NanoDrop 也许是最常用的。NanoDrop 分光光度计家族采用了获得专利的样品保留系统,可以分析体积小至0.5~2.0μL 的样品。使用该仪器只需直接吸取样品到光学“基座“,放下上部的“样品臂"覆盖至样品上,从而由于表面张力生成液状的"样本柱”被保待在适当位置。然后基座移动自动调整为理想的通道长度(1mm) 。之后用装在基座上的两个光纤(发射光的疝气灯)与样品臂[线性电荷耦合( CCD ) 阵列探测器的光谱仪]进行光谱测定。最早的NanoDrop 仪器——NanoDrop ND-1000 紫外/可见分光光度计的波长范围为220 ~ 750nm, 可以测定lμL 浓度为2 ~ 3000ng/mL 的样品,而不需要稀释, 这比传统分光光度计的范围约宽50 倍。新的NanoDrop 仪器提供了更大的波长范围,扩展了浓度范围与比色槽性能,可一次分析多达96 个样品。 文章转自英格恩生物技术博客! |
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