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当今生物药物在医药领域的临床应用和商业生产中占有重要的地位，中国的生物药物市场年均增长率已达到25%以上，近年来的年产值规模更是突破了12000亿元，远高于其他制造业。 新药研发过程中更需要对药物的有效成分纯度的纯化研究，药物成分的DNA和蛋白质的纯度及浓度需求是否达标也是检验药物是否可用于生产和临床的指标之一。 本文将阐述在这项科研课题中最基础、最基层的一项：层析纯化后DNA的Nanodrop检测结果探究。我们将从中展现一个纯化工艺设计研究的复杂性，以小见大，窥视整个纯化科研的冰山一角。在对DNA完成了层析纯化后，对纯化结果最高效并且最直观定量的检测是分光光度计法检测。Nanodrop分光光度计对DNA浓度测定结果为纳克级别，所需检测样品质量极低。其对紫外吸收峰值的检测也具有极佳的精确度，检测周期也仅为5秒以下。对Nanodrop检测结果的分析，可以使我们很快发现一个层析纯化工艺中存在的问题并对其进行优化。  一个浓度和纯度足够的DNA样品在Nanodrop的检测结果中，紫外吸收峰值A260/A280比值应在1.8-2.0之间，A260/A230的比值应为2.0以上，浓度的检测结果也不会出现异常偏低情况。在对纯化工艺的设计和操作中难免会出现一些异常结果，下文将列举出可能的异常结果并回到工艺设计实验中进行相应的探究，以达到优化工艺，优化结果的目的。  1. A260/A230为负值A260为核酸的紫外吸收峰值，A230是为碳水化合物的紫外吸收峰值。在低浓度的DNA样品中，会因为实验中使用到的缓冲液和其他有机溶剂的干扰检测影响而使A260/A230的比值为负值，这是一种正常的情况。如果是整体样品在稀释检测的情况下出现的普遍浓度过低，可以减少稀释倍数再次测量，负值将会被矫正。当出现浓度过低情况时，如果该检测样品是我们在层析中收样的目的峰，我们调整收峰时间和位置可以避免在出峰浓度较低时收到杂质较多，对整体样品结果影响过大的峰型。在实验设计没有问题的情况下，在峰尖两侧集中收峰能够得到浓度更高的样品。在对实验的目的和设计的环境参数综合考虑下，这种结果也证明我们需要改进出更高收率的纯化工艺设计。如果样品的浓度与其他样本相比并未过低，仍旧出现了A260/A230为负值的情况，则是因为操作问题，再次规范操作复测即可矫正。2. A260/A230小于2.0 证明在收集到的样品中有含有有机溶剂污染，这种现象一般是因为在纯化工艺设计的多步纯化实验中或者在对工程菌的DNA提取实验中出现的有机溶剂在检测前未被完全除去。在对多个样品整体分析，如果这种情况出于偶然和个例样品当中，那么即是因为在实验步骤中操作不到位而导致样品被未清除的有机试剂污染；如果样品普遍出现这种情况，证明在多个纯化步骤中，出现了实验设计的多个缓冲液以及提取过程中的试剂在实验设计中没有被设计除去的情况。此时应该重新审视设计的初纯试剂以及DNA的提取实验步骤设计。  3. A260/A280小于1.8 A280为蛋白质的紫外吸收峰值。纯净的DNA的A260/A280的比值应在1.8。而纯净的RNA的A260/A280的比值应在2.0。在一个DNA的纯化后样品中，如果A260/A280比值在1.8以下，证明样品中有蛋白质杂质污染。这种情况一般为在DNA提取过程中的蛋白质没有被完全除去。在试剂盒提取DNA的实验方法中，可能的原因是设计的蛋白沉淀液的用量计算过少、沉淀时间过短以及离心速度和时间不够。而一般使用的碱法提取质粒DNA中，也会因为以上原因而使蛋白质没有足够沉淀或者沉淀的蛋白质杂质依旧在样品的离心管中。此时应该改进实验过程中的操作方法。 4. A260/A280大于2.0 在DNA的纯化中，由于我们的目的物质是DNA，所以当出现因为A260吸收峰值过高而导致A260/A280比值大于2.0的情况时，可能是其中的RNA影响。同理问题可能出在DNA的提取过程中，因实验操作而导致的RNA未被完全分离除去。一般RNA都会在初纯时就被除去，所以问题只可能出现在初步纯化和提取过程当中。 |
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