核酸质量检测——微量分分光光度法

微量紫外分光光度法

检测原理

微量紫外分光光度法检测的是核酸的纯度和含量，DNA和RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长的吸光度测定DNA或RNA浓度，其吸收强度与DNA和RNA的浓度成正比。

对于一个核酸样品，建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测，电泳可以判断样品是否提取成功，以确认是否还需进行纯度和浓度测定。

核酸浓度计算

针对不同类型的核酸，其浓度的计算方法也并不相同：

• dSDNA = 50 × (A260-A310) × 稀释倍数 (ng/μL)

• ssDNA = 33 × (A260-A310) × 稀释倍数 (ng/μL)

• RNA = 40 × (A260-A310) × 稀释倍数 (ng/μL)

检测过程

以IMPLEN生产的新产品NanoPhotometer N60为例介绍测定核酸浓度的具体过程。

选择检测模式

开机后，系统会自动进入上述界面，点击核酸浓度测定，进入核酸浓度测定界面。

进入核酸浓度测定界面后，点击左侧栏中的dsDNA，在右侧栏中选择待测样品的类型，之后点击最左侧的第一个图标进入样品测定界面。

校准和上样

首先在上样孔处点入1.5μL无菌水，注意点样时不要有气泡残留，扣上样品盖之后，点击页面中的空白，对仪器进行校准。

校准完成之后，应用擦镜纸将无菌水擦干净，之后点入1.5μL待测样品，扣上样品盖之后，点击页面中的样品，对待测样品进行核酸浓度和纯度的测定。

结果获得

上图为最后测得的结果，左侧的曲线为核酸在不同波长下的吸光度，纯的核酸的吸光值，在A230是谷底，在A260是峰顶，在A280则正好是半山坡。

右侧栏为核酸的浓度和纯度信息，当核酸纯度与理想值之间有差别时，仪器会自动表示为黄色感叹号，点击该处，即可给出可能的原因。

核酸纯度评估

双链DNA纯品的A260/A280为1.8，RNA纯品的A260/A280为2.0，故根据A260/A280的值可以估计DNA的纯度。

合格的双链DNA的A260/A280应在1.7～1.9之间，若比值较高说明提取的DNA中有RNA残留，若比值较低说明有蛋白质残留。

合格的RNA的A260/A280应为1.9-2.1之间，如果小于1.8，则表明提取的RNA中蛋白质杂质较多，如大于2.2，则表明RNA发生了降解。

---