雌激素、胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的影响

雌激素、胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的影响

李新锋  

【摘要】： 随着组织工程学的不断发展,对生长板软骨细胞在体内和体外的研究也越来越深入。国内外大量的研究人员利用定量活体标记技术对哺乳类动物(包括人类)、啮齿类动物、禽类及野生动物如蝙蝠等不同种属动物的生长板生长、发育,病变发生、损伤修复机制和软骨内成骨过程等领域进行了广泛而深入的研究。鉴于鸡胚四肢骨骼是研究骨骼发育较为理想的模型之一,同时为了更深入研究生长板软骨发育不良相关疾病,如肉鸡胫骨软骨发育不良(tibial dyschondroplasia, TD),有必要对肉鸡胫骨生长板软骨细胞进行体外培养。通过对获得的生长板软骨细胞在体外的生长及发育特征以及对生长板软骨的全身和局部调节因子如雌激素和胰岛素样生长因子-Ⅰ对其增殖和分化的影响的研究,为肉鸡胫骨软骨生长板软骨发育不良等疾病的深入研究,以及人类和其它动物的软骨体外修复,提供借鉴。 试验一、鸡胚胫骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定 目的：建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞的高效分离法,并对其进行鉴定。方法：设计以1 mg?mL-1的Ⅱ型胶原酶两步消化法,分离制备胫骨生长板软骨细胞,观察其对12～20胚龄鸡胫骨生长板软骨细胞的分离效果；采用不同的染色方法,在倒置显微镜和光镜下观察体外培养条件下软骨细胞的生物学特性。结果：(1)Ⅱ型胶原酶两步消化可使生长板软骨基质完全解离降解,细胞均分离,细胞存活率达90%以上；(2)前两代细胞贴壁生长呈圆形或多角形,单个铺开时体积较大,生长汇合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝(TB)异染反应均呈阳性；第4代以后细胞逐渐变为长梭形,Ⅱ型胶原免疫组化染色减弱,TB异染反应阴性；(3)前三代软骨细胞长期培养下去,能逐渐汇合,并形成软骨块状组织,碱性磷酸酶染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性,甲苯胺蓝染色异染反应较强,茜素红染色能观察到钙化结节。结论：采用两步Ⅱ型胶原酶消化分离鸡胚胫骨生长板软骨细胞,具有细胞收获率、细胞存活率高、操作简便等特点；随着传代培养次数的增加,生长板软骨细胞出现去分化,逐渐失去软骨细胞的特异性表型；软骨细胞若有合适附着基质,长期培养下去能保持较强的成骨能力。 试验二、雌激素对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响 目的：在建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞体外培养方法的基础上,研究雌激素对鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖、分化和代谢功能的影响。方法：取生长状态良好的第二代软骨细胞接种于96孔板,添加不同浓度的雌激素,分别用MTT法、PNPP法测定软骨细胞增殖率和软骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,用全自动生化分析仪检测细胞培养液中的钙、磷、ALP含量。结果：(1)36 h,54 h,25～1600 pg?mL-1的雌激素均显著促进了软骨细胞的增殖(P0.01)。其中,作用54 h,200,400,800pg?mL-1的雌激素促增殖作用显著；(2)54 h,400、800 pg?mL-1的雌激素显著促进生长板软骨细胞内ALP活性(P0.01),1600 pg?mL-1的雌激素则显著抑制软骨细胞内ALP活性(P0.01)；(3)细胞培养液中钙浓度：在36 h,400、800 pg?mL-1雌激素作用下,明显降低,18 h,400 pg?mL-1,明显升高,54 h,随雌激素的浓度增加而增加；磷浓度：400、800 pg?mL-1雌激素作用下,在各个时间段都处于较高的水平；ALP活性：在18 h,对照组和800 pg?mL-1含量较高,36 h,100、200、800 pg?mL-1明显降低,54 h,随浓度的增加,各组ALP呈下降趋势。结论：雌激素能显著促进软骨细胞的增殖；使软骨细胞内的ALP显著增加；但浓度越大,则呈现明显的抑制作用；细胞培养液中钙、磷随培养时间延长而增高,ALP则随时间增加而降低。 试验三、胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响 目的：在建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞体外培养方法的基础上,研究重组IGF-Ⅰ对鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖、分化和代谢功能的影响。方法：取生长状态良好的第二代软骨细胞于96孔板上进行重组IGF-Ⅰ作用下,用MTT法测定软骨细胞增殖率,PNPP法测定软骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,并用全自动生化分析仪测定体外培养软骨细胞培养液中的钙、磷及ALP含量。结果：(1)在36 h,10、15、20 ng?mL-1的IGF-Ⅰ使软骨细胞增殖受到抑制(P0.01),随作用时间的增加各种浓度作用下的软骨细胞,均有增殖,但差异不显著；(2)在36 h,10、20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可显著促进软骨细胞内ALP活性(P0.01)。54 h,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可显著促进生长板软骨细胞内ALP活性(P0.01)；(3)软骨细胞培养液中的钙、磷随IGF-Ⅰ浓度的增加而减少,随培养时间延长,其浓度有所增加。在18 h,10 ng?mL-1的IGF-Ⅰ抑制了生长板软骨培养液中ALP的活性,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ促进了软骨细胞培养液中ALP的活性。随培养时间的延长,ALP活性下降。结论：IGF-Ⅰ不能显著促进软骨细胞的增殖；但能显著增加软骨细胞内ALP的活性；随培养时间延长,细胞培养液中的钙、磷有所增加,而ALP则下降。

【关键词】：生长板软骨细胞 雌激素 胰岛素样生长因子-Ⅰ 鉴定 增殖 分化 【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-13
• 符号及缩略语说明13-15
• 上篇 文献综述15-37
• 第一章 软骨内成骨研究进展15-21
• 1 软骨内成骨的过程15-16
• 2 生长板软骨细胞的分区及其功能16-20
• 2.1 静止细胞带(The resting zone)17
• 2.2 增殖细胞带(The proliferating zone)17-18
• 2.3 软骨细胞肥大带(The hypertrophic zone)18-19
• 2.4 钙化带(The calcified zone)19
• 2.5 骨化带(The ossification zone)19-20
• 3 软骨细胞凋亡(The apoptosis of the chondrocyte)20-21
• 第二章 雌激素和IGF-Ⅰ对胫骨生长板软骨作用的研究进展21-30
• 1 雌激素对胫骨生长板软骨的作用21-23
• 1.1 体内研究21-22
• 1.2 基因敲除动物模型22-23
• 2 IGF-Ⅰ对胫骨生长板软骨的作用23-26
• 2.1 GH和IGF-Ⅰ对骨纵向生长的假说23-24
• 2.2 全身性和局部IGF-Ⅰ对骨纵向生长的作用24
• 2.3 IGF系统在胫骨生长板软骨中的分布24-26
• 参考文献26-30
• 第三章 肉鸡胫骨软骨发育不良研究进展30-37
• 1 临床症状30
• 2 病因30-33
• 2.1 生长因子30-31
• 2.2 维生素D_3及其代谢物31
• 2.3 遗传因素31
• 2.4 营养因素31-32
• 2.5 饲养管理32-33
• 3 病理发生33-34
• 4 防治34
• 4.1 遗传选育34
• 4.2 维生素D_3及其衍生物34
• 4.3 减缓生长速度34
• 5 展望34-35
• 参考文献35-37
• 下篇 试验研究37-79
• 第四章 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的体外培养与鉴定37-59
• 1 材料与方法37-41
• 1.1 材料37-38
• 1.1.1 试验动物37-38
• 1.1.2 主要试验试剂38
• 1.1.3 主要仪器及设备38
• 1.2 方法38-41
• 1.2.1 鸡胚胫骨生长板石蜡切片染色观察38-39
• 1.2.1.1 胫骨组织石蜡切片38
• 1.2.1.2 H?E染色38-39
• 1.2.1.3 甲苯胺蓝染色39
• 1.2.2 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的培养39-40
• 1.2.3 细胞的形态学观察40
• 1.2.4 体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测40
• 1.2.5 体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的染色观察40-41
• 1.2.5.1 Gimsa染色40-41
• 1.2.5.2 H?E染色41
• 1.2.5.3 甲苯胺蓝染色41
• 1.2.5.4 碱性磷酸酶染色41
• 1.2.5.5 茜素红染色41
• 2 结果41-53
• 2.1 胫骨组织石蜡切片41-44
• 2.2 倒置显微镜下观察体外培养生长板软骨细胞44-47
• 2.3 Ⅱ型胶原免疫组化染色47-49
• 2.4 甲苯胺蓝染色49-50
• 2.5 常规染色结果50-53
• 3 讨论53-56
• 3.1 关于生长板软骨细胞的研究53-54
• 3.2 生长板软骨细胞的体外培养54-55
• 3.3 关于生长板软骨细胞的长时间培养55-56
• 3.4 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的染色鉴定56
• 4 小结56-57
• 参考文献57-59
• 第五章 雌激素对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响59-69
• 1 材料与方法59-61
• 1.1 材料59-60
• 1.2 方法60-61
• 1.3 数据分析61
• 2 结果61-65
• 2.1 雌激素对体外培养生长板软骨细胞作用的OD值61-62
• 2.2 雌激素对生长板软骨细胞内ALP的OD值62-63
• 2.3 雌激素对生长板软骨细胞培养液中钙、磷、ALP的影响63-65
• 3 讨论65-66
• 4 小结66-67
• 参考文献67-69
• 第六章 IGF-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响69-79
• 1 材料与方法70-71
• 1.1 材料70
• 1.2 方法70-71
• 2 结果71-74
• 2.1 IGF-Ⅰ对体外培养生长板软骨细胞作用的OD值71-72
• 2.2 IGF-Ⅰ对生长板软骨细胞内ALP影响的OD值72-73
• 2.3 IGF-Ⅰ对生长板软骨细胞培养液中钙、磷、ALP的影响73-74
• 3 讨论74-76
• 4 小结76-77
• 参考文献77-79
• 全文总结79-81
• 创新之处81-83
• 致谢83-85
• 攻读硕士学位期间发表的论文85-87
• 附录87-88