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1． 目的 检测小分子蛋白抗体 2． 技术原理 将经电泳分离的抗原转印到膜上作为固相,利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体 3． 适用范围 单克隆抗体和多克隆抗体 4． 技术操作 4.1 试剂配制 4.1.1 40% Bis-acrylamide with 2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05） 丙烯酰胺 77.9g 双甲叉丙烯酰胺 2.1g Total 200ml 4.1.2 30%胶溶液: 0.8 双甲叉丙烯酰胺 0.8g 29.2% 丙烯酰胺 29.2g total 100ml 4.1.3 3M TrisHCl , pH 8.45 36.3g Trisbase Total 100ml 4.1.4 WG ( water + Glycerol): Water: 58ml Glycerol: 36ml Total: 94ml 4.1.5 10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3 （to make the working buffer, just dilute 10 times. Do not adjust pH , pH should be 8.3.） Trisbase 60.5g Tricine 89.5g SDS 5g total 500ml 4.1.6 10% SDS SDS 10g Total 100ml 4.1.7 2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8: 0.25M Tris 15.14g 0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS total 500ml 4.1.8 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7: Stock: to use: 20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock 10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml 250mM Tris 15.14g bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 4.1.9 transfer buffer 48mM Tris base 5.81g 39mM Glycine 2.93g 0.037% SDS 0.375g or 1.875ml of 20% SDS 40% MeOH 400ml total 1000ml 4.1.10 TBST 10mM Tris-HCl, pH7.4 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml 4.1.11 稀释液 TBST+ 5% 脱脂奶粉 4.1.12 ECL底物溶液 A液1ml + B液1ml，临用时配制 4.1.13 DAB底物溶液 DAB(3,3二氨基联苯胺) 50mg 0.05mol/L Tris-Base（PH7.6） 100ml 先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，使用稀释，临用时加入30%H2O2，在工作液中终浓度0.01％ 4.1.14 PSQ膜 4.1.15 甲醇 4.1.16 显影液 4.1.17 定影液 4.1.18 X光胶片 4.2 操作步骤 4.2.1 Tricine-SDS-PAGE（分离胶、间隙胶、浓缩胶配方参见附录） 4.2.1.1 做分离胶，加水封胶，待其凝固。 4.2.1.2 做间隙胶，加水封胶，待其凝固。 4.2.1.4 待浓缩胶凝固后，拔掉梳子，并将架子转移到电泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis Buffer pH8.3，点样。 4.2.2电转印 4.2.2.2 转移。在电转移仪上铺好滤纸，膜和胶，如图。滤纸一般用三层，滤纸和膜、膜 和胶之间一定不能有气泡。装好电转移仪, 根据需要选定所需的电流。转移时间一般为2.5 小时,( 1mA-2mA/cm2, 10% gel), 可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.转移过程中随时观察电压的变化,如有异常应及时调整.
4.2.3 免疫印迹 4.2.3.1 转移结束后，将膜放入稀释液中封闭，4℃孵育16小时 或 室温孵育1小时 4.2.3.2 按需求稀释一抗，加在膜上相应的位置，室温 孵育1小时 4.2.3.3 用 TBST洗三次,每次5min 4.2.3.4 加酶标二抗，室温孵育1 小时. 一般采用HRP标记的二抗, 稀释比例为1:5000（参考：一张膜，10ml 牛奶 2ul二抗，两张膜，20 ml 牛奶4ul二抗） 4.2.3.5 用TBST洗三次,每次5min 4.2.3.6 显影。在暗室里，将PSQ膜泡在ECL底物溶液1分钟左右(一般每张膜,用1.6ml-2.0ml的反应底物)，然后用保鲜膜将PSQ膜包好，放入暗盒；关掉日光灯，打开红外灯，取出胶片，折左上角作记号，铺到膜上，夹好暗盒；1分钟后取出胶片，放入显影液中，轻轻振荡，3分钟后取出，清水洗涤一次，放入定影液中，轻轻振荡，3分钟后观察结果，并根据第一张的曝光情况，调整下面胶片的曝光时间和曝光区域 4.2.3.7显影完后收拾好暗室的物品，带胶片离开 4.2.3.8 也可用DAB底物溶液显色 4.3附录 分离胶、间隙胶及浓缩胶配方比例 分离胶配方： 15%
间隙胶配方： 10%
浓缩胶配方：4%
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