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黎介寿：谷氨酰胺与巨噬细胞的代谢及免疫调节作用 http://www.21food.cn/html/news/24/40695.htm 2005-03-03 12:30:00 作者：施鑫 黎介寿 单位：(南京军区南京总医院解放军普通外科研究所，江苏南京 210002)
摘要：谷氨酰胺(Gln)是循环和体内氨基酸池中含量最丰富的氨基酸：创伤后机体免疫功能损害与血中谷氨酰胺浓度下降密切相关。单核巨噬细胞是免疫系统的组成部分，在免疫反应中起重要作用。研究表明谷氨酰胺是单核巨噬细胞主要的代谢底物，通过谷氨酰胺酵解途径，为细胞代谢提供能量；为细胞合成DNA和mRNA提供嘌呤、嘧啶、核苷酸生物合成前体；提供氨基葡萄糖，GTP和NAD+合成的氮前体。单核巨噬细胞的免疫功能依赖于谷氨酰胺的含量，包括吞噬功能、细胞因子合成和分泌以及抗原提呈等功能。通过特殊的营养支持以增加肌肉和血中Gln浓度，改善应激状态下的免疫功能抑制，为临床营养支持治疗可提供有益的途径。
引言
谷氨酰胺(Gln)是血液循环和体内游离氨基酸池中含量最丰富的氨基酸，健康成人血浆Gln浓 度接 近于 1 mmol/L，大鼠约为0.6 mmol/L［1］。一些组织和细胞是Gln的主要代谢场所 。 愈来愈多的体外研究表明，即使不具备增殖、分化特征的单核巨噬细胞系统(MΦ)对Gln也有很高的利用率［2］。单核巨噬细胞系统是机体免疫系统的组成部分，是调节各种免疫紊 乱的 重要环节，不仅具有非特异炎症反应能力(趋化、吞噬、杀菌)，而且具有特异性免疫应答功能。
1 谷氨酰胺的生物化学特性
1.1 性质与特征
Gln是5碳氨基酸，含有两个氨基(α- 氨基和酰胺基 )。在生理pH条件下，羧基带负电荷，氨基带正电荷，分子净电荷为零，属于中性氨基酸。由于它含两个氨基特性，决定了它在器官之间氮的运输和作为氨载体的重要性，循环中30%～ 35% 的氨基酸转运依靠Gln完成，故Gln被称之为“氮梭(nitrogen shuttle)［3］。
Gln具有生糖作用，组织细胞摄取循环中的Gln经氧化释放能量，每克分子Gln通过α-酮戊二酸进 入三羧酸循环(the kerb,scycle)完全氧化可产生30克分子的ATP［4］，与葡萄糖(36 molATP/mol)一样是高效的能源底物。Gln所含的酰胺氮对所有细胞的生物合成是绝对必需的，体内细胞利用Gln可合成嘌呤、嘧啶、氨基糖以及其他氨基酸［5］。因此，Gln 是蛋白质代谢的重要调节因子，促进细胞内蛋白质的合成，减少骨骼肌蛋白的分解，被认为 是机体在应激状态下的条件必需氨基酸，对于调节应激状态下的细胞代谢和调节免疫细胞的 功能具有重要的意义。
1.2 巨噬细胞内Gln代谢
1995年，Eagle等［6］ 研究了组织培 养中的营养需要，注意到Gln的需要量远远超过其他氨基酸。若培养基中缺乏Gln将导致细胞死亡。一些以快速增殖为特征的细胞对Gln具有很高摄取率，如肠粘膜细胞、免疫细胞、成纤维细胞等。巨噬细胞是终末细胞，不再具有增殖、分化能力，然而它是代谢活性细胞，以分泌蛋白质、膜蛋白再循环为特征，对Gln同样具有很高的利用率和代谢率［7］。巨噬细胞内不含谷氨酰胺合成酶，胞内Gln主要来源于骨骼肌的合成、释放，从血液循环中摄取，经跨膜转运进入细胞内。Gln跨膜转运需要通过胞膜上的吸收载体系统，主要有两大类 ：
①N系统：属于Na+依赖的Gln转运系统；
②ASC系统：是Na+依赖的中性氨基酸转运系统，可转运丝氨酸、天冬酰胺和组氨酸等。
N系统受细胞内pH值的调节，ASC系统依赖于激素调节，共同维持胞内Gln平衡和代谢需要［8，9］。
葡萄糖曾被认为是免疫细胞的唯一能源底物，随着对Gln代谢作用的深入研究，发现Gln也是免疫细胞的重要能源物质，即使是在静息状态下，巨噬细胞的Gln利用率也很高，甚至高于对葡萄糖的利用率(表1)。
表1 巨噬细胞对Gln的利用率
Table 1 The use of Gln by macrophage 细胞来源 条件 利用率(μmol/h*mg) 文献 小鼠腹腔巨噬细胞 静息 190 7 小鼠腹腔巨噬细胞 静息 90 10 大鼠肝Kupffer细胞 静息 6.1 11
巨噬细胞内含有多种Gln的代谢酶，其中涉及几个主要关键酶：如谷氨酰胺酶、谷氨酰胺脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶等。谷氨酰胺酶是催化Gln分解成谷氨酸和氨的起始酶，在调节细胞内Gln代谢中负主要责任。对大鼠巨噬细胞关键酶的研究表明，巨噬细胞能够大量利用Gln，其谷氨酰胺酶的活性是淋巴细胞的4倍［12］，提示Gln对巨噬细胞的重要性。巨噬细胞中Gln的代谢主要是以不完全氧化方式进行，Gln分解成谷氨酸后，通过天冬氨酸转氨酶的转氨基作用，而不是经过谷氨酸脱氢酶的氧化脱氨基作用产生α-酮戊二酸进入三羧酸循环，丙氨酸经天冬氨酸转氨酶 的转氨基作用产生α-酮戊二酸进入三羧酸循环［13］。McKeehan［14］将Gln部分氧化代谢途径命名为Gln酵解，其主要代谢产物有谷氨酸、天冬氨酸和氨；其次为丙氨酸、乳酸和丙酮酸。通过酵解途径产生的中间代谢产物，为高活性的巨噬细胞蛋白合成提供 必需的代谢底物，是巨噬细胞行使其免疫功能所必需的。巨噬细胞对Gln连续不断的高代谢率，为其快速、有效的免疫应答反应提供适宜的条件。Gln在巨噬细胞的代谢特征，至少有三个意义：
①为巨噬细胞提供能量ATP，维持其高代谢活性；
②为细胞合成DNA和mRNA提供嘌 呤、嘧啶、核苷酸生物合成的前体物质；
③提供氨基葡萄糖、GTP和NAD+合成的氮前体物质。
2 谷氨酰胺代谢调节
2.1 激素
感染、创伤等应激状态下，血浆糖皮质激素、甲状腺素分泌增加，胰岛素分泌减少，机体处于高代谢状态 ，谷氨酰胺酶是Gln分解代谢的起始酶，其活性受激素的调节。Coast等［15］研究胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素对培养大鼠巨噬细胞酶活性的影响，巨噬细胞来自大鼠腹腔，在含上述激素的培养液中培养48 h，测定己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷氨酰胺酶、枸橼酸合成酶的最大活性，发现胰岛素增加枸橼酸合成酶和己糖激酶的活性，降低谷氨酰胺酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性。地塞米松对谷氨酰胺酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性影响与 胰岛素相似，而甲状腺素能增加谷氨酰胺酶和己糖激酶的活性。Rosa等［16］研究指 出，胰岛素对Gln在巨噬细胞代谢中的作用，通过测定谷氨酰胺酶的活性、Gln代谢利用率，结果显示胰岛素增加糖代谢，减低谷氨酰胺酶的活性，减少Gln代谢利用率。提示机体在应 激状态下，一些激素能够通过调节谷氨酰胺酶的活性，促进Gln的代谢，增加巨噬细胞对Gln 的利用率，调节巨噬细胞的功能。
2.2 自身调节
巨噬细胞被激活后，代谢活性明显增加 ，表现为细胞内对Gln的摄取和利用比静息状态下显著升高。在其活化的早期，伴随着巨噬细胞体积明显增大［17，18］。Wu等［19］推测巨噬细胞体积改变能够调节胞内Gln代谢，实验观察了渗透浓度和蔗糖介导的巨噬细胞体积改变对Gln代谢的影响，在37℃条件下，用K rebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)孵育巨噬细胞10～16 min，通过减少NaCl(从119～84 mmol/L)来降低细胞外液的渗透浓度(336～286 mmol/L)使细胞体积增大，结果随着细胞的体积增大，Gln的代谢增强；相反增加细胞外渗透浓度，细胞体积缩小和Gln代谢减弱。在相同渗 透 浓度下(336 mmol/L)加蔗糖50 mmol/L，比单纯添加25 mmol/L NaCl，Gln的代谢要高得多。 提示巨噬细胞能够通过吞饮摄取蔗糖来诱导细胞体积增大，达到增加Gln代谢的目的。当巨 噬细胞受免疫激活时，Gln代谢的增强，其原因至少有部分与相伴随的细胞体积增大有关。
3 谷氨酰胺与巨噬细胞的免疫功能
3.1 Gln是巨噬细胞的重要能源底物
巨噬细胞是高代谢活性细胞，能源底物的提供是维持其高代谢活性的基本条件。Nemsholm等［7］观察培养条件下小鼠腹腔巨噬细胞内ATP含量的变化，发现巨噬细胞内ATP的周转率是每分钟10次，而体外灌注的大鼠心肌细胞内ATP的周转率，在最大工作量时是22次，表明为维持巨噬细胞的高代谢活性功能，提供充足的代谢能源底物是极其重要的。Spolarics等［11］采用同位素示踪法，观察葡萄糖、Gln、精氨酸等在大鼠肝Kupffer细胞内的代谢状况，发现约35%的ATP 来源于Gln的氧化，而不到20%的ATP来源于葡萄糖。对小鼠腹腔巨噬细胞的研究，也获得相 同的实验结果。Spittler等［20］人的外周血单核巨噬细胞的体外培养表明，随培养 液中Gln的浓度下降，细胞内ATP含量随之降低。巨噬细胞对Gln高利用率研究结果表明，Gln 是提供和维持巨噬细胞内三羧酸循环的重要代谢底物，是巨噬细胞的主要能量来源。
3.2 Gln与巨噬细胞吞噬功能
吞噬和吞饮作用是巨噬细胞的重要功能，通过吞噬和吞饮作用清除微生物、外源性颗粒以及肿瘤细胞。体外研究表明，巨噬细胞的吞噬功能是依赖Gln的浓度，通过摄取合适的颗粒来测定其吞噬功能。Parry-Billings等［21］用125I标记的酵母细胞，在体外观察小鼠腹腔巨噬细胞摄取125I标 记的酵母细胞能力，当培养液中Gln的浓度大于0.03 mmol/L时，吞噬能力明显增强，Gln的 浓度超过1 mmol/L(相当小鼠血浆浓度)其吞噬能力趋于饱和。Wallace［22］用5 1Cr标记的绵羊红细胞(SRBC)，在体外实验中获得同样的结果。Kweon等［23］在体 内实验中发现，给予患肿瘤的大鼠灌注Gln，能够改善大鼠肾上腺巨噬细胞吞噬SRBC的能力 。
吞噬功能是巨噬细胞能量消耗的过程，涉及底物氧化利用、磷脂和膜蛋白的合成。巨噬细胞 的吞噬和吞饮运动依赖于细胞骨架的完整，细胞骨架结构的损伤将导致细胞的吞噬和吞饮功 能下降。Hinshaw等发现细胞内ATP水平降低，细胞的骨架结构发生改变，影响了细胞的吞噬 功能。同时描述了Gln对细胞内ATP的保护作用，表明细胞内ATP含量是影响巨噬细胞吞噬功 能的因素之一［24］。提示Gln可以通过改变细胞内ATP含量的途径，影响巨噬细胞 的吞噬功能。
巨噬细胞的免疫吞噬功能是依赖于细胞表面受体的表达。Dini等［18］研究了大鼠肝 Kupffer细胞的形态学和特异性受体介导的吞噬功能之间的关系，采用LaCBSA标记的胶体金颗粒测定其吞噬功能，应用三维图像和超微结构的分析结果，显示Kupffer细胞受体介导的吞噬功能明显受细胞形态的影响(细胞的体积、表面微绒毛和伪足)，随着细胞体积增大、微绒毛和伪足的数量增加，表面受体的表达增多，其粘附和摄取胶体金颗粒的能力增强。Spit ter等［20］对外周血单核巨噬细胞的研究表明，低浓度的Gln可下调细胞表面受体的 表达，特别是高亲和性IgG(FCrRI/CD64)和CR3(CD11b/CD18)的表达，导致其吞噬致敏的IgG 的能力下降。
3.3 Gln与巨噬细胞的分泌功能
单核巨噬细胞RNA的合 成是调节蛋白 质生成的重要步骤，包括膜蛋白、分泌性蛋白(TNF-α、IL-1和IL-6等)以及合成溶酶体 酶 ，也是免疫应答的基本功能［25］。Gln在巨噬细胞内的代谢大约5%～25%是被完全 氧化，而大部Gln经酶解途径产生谷氨酸、天冬氨酸、氨和CO2。因此，巨噬细胞对Gln的 高利用率，除了提供细胞活动的燃料外，还能为细胞合成RNA和DNA所需的嘌呤提供氮源。Wa llace和Keas［22］研究发现，体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞的RNA合成依赖于培养基 中的Gln，当浓度自0.5 mmol/L下降至0.125 mmol/L时，掺入到RNA中的3H-尿嘧啶下降25 % 。表明尿嘧啶的合成过程是需要Gln的，当细胞外的Gln供应不足时，尿嘧啶的含量下降，导致细胞的RNA合成障碍。Moskovitz等证实在巨噬细胞的最后分化阶段，Gln对于膜磷 脂的mRNA的合成是必需的［26］。
细胞因子(TNF-α和IL-1等)是免疫反应的主要调节因子，主要来源于被激活的巨噬细胞， 不同的巨噬细胞亚群分泌细胞因子的种类和能力存在明显差异。Wallace和Keas［22］研究了体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞，在不同浓度的Gln培养液中，观察巨噬细胞分泌IL - 1的能力，结果当Gln浓度从2 mmol/L降至0.03 mmol/L时，IL-1的分泌量减少了35%；缺乏G l n的培养液中，IL-1的分泌下降60%，表明巨噬细胞合成和分泌IL-1的能力是依赖Gln的。同样Mos kovitz等［26］也观察到在巨噬细胞的最后分化阶段，Gln对于合成TNF-α和IL-1 是必需的。
3.4 巨噬细胞的抗原呈递功能
巨噬细胞是机体主要的抗原呈递细胞，能够表达大多数Ⅱ型组织相容性抗原复合体(MHC-Ⅱ)，人类MHC-Ⅱ基本基因产物主要是 HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，大鼠是与MHC-Ⅱ相关联的Ia,在向辅助T淋巴细胞(CD4+)呈 递 抗原起关键作用。外来抗原必需经巨噬细胞的加工后，与MHC-Ⅱ分子结合成复合物表达于 胞膜上，才能特异性地与T淋巴细胞受体(TCR)结合。最近研究表明，单核巨噬细胞MHC-Ⅱ 表达的改变能够预测外科手术后感染的发展，感染和脓毒症死亡率与HLA-DR表达是一致的 ［27］。Spittler A等［20］研究正常人外周血单核巨噬细胞在体外培养中 ，Gln浓度对细胞表面抗原表达的影响。当Gln浓度从2 mmol/L(正常细胞培养浓度)下降到50 μmol/L时，使HLA-DR表达下降了58%。当Gln从600 μmol/L浓度(血浆生理浓度)降至20 0 μmol/L浓度(重危病人浓度)时，HLA-DR表达显著下降，同时观察低浓度Gln对细胞表面 抗 原印迹的影响，如IgG的Fc受体(Fc RI/CD64)、补体受体型(CR3/CD11b)、补体受体型(CR4/C D11c)，均有不同程度的下降。这些体外实验结果表明，单核巨噬细胞的抗原呈递功能是依 赖于Gln。巨抗原呈递功能降低，直接影响巨噬细胞的特异性免疫功能，进而波及体液免疫 ，导致机体特异性免疫应答能力的低下。
许多临床资料表明，创伤、烧伤、脓毒症、外科手术等应激状态下出现的机体免疫功能抑制，伴随肌肉和血浆Gln浓度的显著下降［28～30］，Gln供应不足可影响单核巨噬细胞免疫功能的表达，机体的细胞和体液免疫受抑制。因此，维持肌肉和血浆Gln的水平将有利于改善机体的免疫功能。血浆Gln来源于小肠对食物蛋白质的吸收，体内几种组织如肝、肌肉、脂肪和肺等能够合成、释放Gln，其中最重要的是骨骼肌，不仅能合成Gln，而且能够像肝贮存糖原一样储存Gln，并通过膜表面的特殊载体释放。Newshlme认为在严重创伤、大手术后和脓毒症期间，蛋白质分解代谢产生的中间产物，除了为糖异生和肝合成蛋白质提供前体外，还通过维持肌肉内的有效氨基酸池(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等)，为肌肉合成Gln提供氮源。因此，在应激状态下，单纯改善机体的氮平衡，而不维持血浆Gln的浓度，可能是没有价值的，甚至可能损害机体的免疫系统，不利于病人的康复［31］。术后给予生长激素能够维持肌肉内游离Gln的水平、改善总体的氮平衡。Mjaalan d等观察了胃肠手术后给予TPN支持应用生长激素的效果，发现生长激素能够阻止Gln和氨基 酸从前臂肌肉组织中丢失
综上所述，Gln的高利用率对维持和精确调节巨噬细胞的免疫功能是十分必要的，应激状态下出现的免疫抑制与低血浆浓度的Gln有关。因此，维持血浆Gln的浓度有利于改善单核巨噬细胞的功能，是调节机体免疫紊乱的重要环节。提示能够通过特殊的营养支持以增加肌肉和血浆Gln的浓度，改善机体应激时的免疫功能抑制状态，为临床营养支持治疗提供了一个有益的途径。
作者简介：施鑫(1963-)，男，江苏南京人，主治医师，医学硕士，从事骨科及创伤外科专业。 |
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