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【LindaLin的回答(40票)】: 其实知乎上我很少很少遇到恰好是我的专业知识能回答的问题，但是难得遇到了一个呢，说实话我又不太想回答，因为这个问题太具体了，认真回答固然会对题主很有帮助，但对其他大多数人一点用处也没有。而作为回答这题的我来说，自然也得不到多少赞——对不起，这样看起来我是很功利，可是谁不是呢，答题是需要花时间和精力的，如果没有奖励机制的反馈会有多少人还愿意去写高质量的答案？ 其实我很想推荐题主去小木虫上问这类专业问题。但说实话我自己都觉得小木虫更不行。我自己也到小木虫上问过一些实验上的问题，并诚心地放上了QQ希望能与其他做那个实验的人交流，但基本得不到自己想要的解决答案，反而有很多同样遇到问题的人来请教我，我自己一点好处也没有，还要花时间去教别人，而且我自己的理解也很有限。 题主很诚恳，具体描述了自己的问题希望得到解答，正如我当初在小木虫上提问的时候一样，我可以想象题主希望得到答案的心情，但我忍不住告诉题主：专业上的问题想要得到解决，最好的办法还是自己查阅资料/求助学长老师来寻找答案。尽管我认真地回答了你的问题，只是你这次运气好罢了，不代表今后你都能通过这样的途径找到答案。 =====接=下=来=是=对=问=题=的=回=答===== 要通过某波长的吸光度来测定在某种溶剂中的某物质浓度，有两个必要条件：1、该物质在某波长有吸光度；2、该物质在该波长的吸光度（在一定浓度范围内）有浓度依赖性。 这里我用我自己通过吸光度测过的某物质浓度作为例子来说明： 该有机物质A可溶解在乙醇中，暂时没有别的方法定量检测这种物质，所以我想到了用吸光度来测定其浓度。我用的是酶标仪，应该也可以使用紫外分光光度计。 首先你要知道物质A都在哪些波长有吸光度，也就是你应该先对物质A的乙醇溶液扫个全波长的紫外光谱图： 
这是200mg/ml A的乙醇溶液的光谱图，出峰在200-300nm之间。（第一个必要条件）（扫峰的精度可以较低，如每10nm测一个点）这是200mg/ml A的乙醇溶液的光谱图，出峰在200-300nm之间。（第一个必要条件）（扫峰的精度可以较低，如每10nm测一个点） 接下来我配置了不同浓度的A的乙醇溶液，提高精度（如每2nm一个点）扫一下200-300nm之间的峰：
浓度较高时出峰位置会红移，并且OD值过高时也不呈线性。降低浓度继续测：
10mg/ml以内时红移依然存在，但1mg/ml以内时OD maximun值基本在同一波长（204nm），而且看起来线性比较好，于是我选取这个范围的浓度-OD值来作标准曲线：10mg/ml以内时红移依然存在，但1mg/ml以内时OD maximun值基本在同一波长（204nm），而且看起来线性比较好，于是我选取这个范围的浓度-OD值来作标准曲线：
线性良好，于是我就可以用这个标准曲线去测定未知浓度的A溶液在204nm的OD值，从而计算其浓度了。（前提是该未知浓度在1mg/ml以内，如果高于此浓度要稀释，如果过高就不适合用这个方法测定了，误差过大。）线性良好，于是我就可以用这个标准曲线去测定未知浓度的A溶液在204nm的OD值，从而计算其浓度了。（前提是该未知浓度在1mg/ml以内，如果高于此浓度要稀释，如果过高就不适合用这个方法测定了，误差过大。） 这就是用吸光度测定物质浓度的过程和原理。所以回答你的问题： 如果不是物质的出峰位置，比如我这里的A物质，它再200-300nm之间出峰（有吸光度），你如果测500nm，浓度再高测出来也是0；你如果测230nm，线性不一定好。 ======回=答=完=毕====== 回答完以后我意识到，这类问题就算提问和描述写得再认真，也还是与伸手党无异。 我认为知乎存在的意义在于交流和讨论，而不是提问和标准答案。 引以为戒，今后不再回答或提问此类问题。 【赖嘉卓的回答(2票)】: 实验没事就要测药物紫外吸收的路过…首先回答问题，确实用别的波长也可以测吸光度，但总有那么几个特定波长最好，无论是吸光度大小还是其选择性都足够理想。下面是原理部分：吸光度是由于物质中的共轭结构，双键等对于紫外波长的能量因为分子振动能够吸收，使得紫外光通过样品溶液后会发生固定比例的吸收，于是就有了透光率。因为透光率应用起来，和样品溶液浓度不是线性关系，不便使用。对透光率去对数之后就得到了吸光度，和样品溶液成正比关系，可以使用朗博比尔定律求出待测物浓度。于是关键就来了，样品在紫外波长都有吸收，但是有的大有的小，为了提高灵敏度我们选择吸收度最大的几个波长。另外为了与杂质还有溶剂的吸收区分开来（一般杂质还有溶剂的吸收在短波区就会结束了），我们会选择最大吸收波长，比如254nm，280nm都有吸收，但可能254nm杂质也有吸收，于是选择280nm作为检验波长。吸光度虽然在朗博比尔定律中和浓度有线性关系，但范围不大，一般吸光度在0.6~1.0的线性比较好，这也影响了波长的选择，如果一个波长虽然有吸收峰，但如果太小也是不会选用的。实际应用中主要通过选择样品溶液浓度来矫正吸光度。最后再附送一个，透光率与波长作图本来是一个多凹峰的曲线，为了使用方便与美观，我们看到的都是做了镜像对称的正向吸收峰。嗯，就是这样。总的来说，虽然一个物质可能从254nm到500nm都有紫外吸收，但只有几个波长有吸收峰，剔除掉杂质和溶剂吸收峰的干扰，就剩下一两个最理想的波长用于测定了。 原文地址:知乎 |
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