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作者：复旦大学附属中山医院检验科 周佳烨, 吴炯, 潘柏申 糖尿病是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的以慢性高血糖为主要特征的全身性代谢异常疾病。目前糖尿病在全世界的主要发病病因中占第3位。且糖尿病死亡率的逐年递增, 已成为仅次于心血管疾病和癌症的第三大死亡原因。据估计, 目前全球范围内糖尿病患者将达2亿, 而我国糖尿病患者数约为 4 千万, 发病率已上升到2.5%~3.25%。近期诸多地方性的调查显示糖尿病的发病率逐年增高。糖尿病患病率的增加带来了医疗费用的大幅上升, 用于糖尿病患者的人均费用是非糖尿病患者的 4 倍。 糖尿病的危害主要在于由高血糖引起的严重并发症, 包括肾功能衰竭、视力丧失及心血管疾病等。降低血糖水平能控制和延缓并发症的产生发展。糖化血红蛋白(glycated hemoglobin, GHb)可反映人体内2~3个月内的平均血糖水平, 且不依赖于患者的其他条件(如抽血时间、是否空腹、是否应用胰岛素等), 已成为糖尿病病情监测和疗效观察的重要指标。 一、GHb的发展历史 GHb是红细胞内血红蛋白(Hb)与血中糖化合物相结合的产物, 通常占总Hb的 5%~8%。1958年, Allen等首次发现了GHb由HbA1a(约占1.6%)、HbA1b(约占0.8%)和HbA1c(约占3%~6%)3种成分组成。HbA1c 是其中最重要的亚组分, 占HbA1的70%~90%。1966年, Holmquist等初步揭示了HbA1c是结合了葡萄糖的血红蛋白A, 其血红蛋白β 链氨基-末端缬氨酸残基通过非酶促糖化作用以共价键与葡萄糖分子相连接, 是一种不可逆反应。19681969年, Rahbar等研究证实糖尿病与GHb升高相关; 1976年, Bunn发现糖尿病时升高的GHb主要是 HbA1c。1976年, Koenig等证实 HbA1c 水平与空腹血糖浓度相关, 随后大量临床研究证实这一观点。1982年证实了HbA1c水平在红细胞生命周期中动态变化, GHb的形成过程存在于红细胞整个120 d的生命周期中。GHb的形成速率与血糖浓度(红细胞内的葡萄糖浓度)有关, 而与胰岛素无关。这些研究初步奠定了GHb临床应用的基础。 二、GHb的形成和命名 GHb的形成过程通常分为两步, 首先是糖的羰基与Hb氨基在非酶促的条件下形成亚胺醛(aldimine), 此步骤是可逆反应, 与血糖浓度直接相关。在红细胞生命周期中部分亚胺醛通过Amadori重排形成稳定的酮胺化合物。 1986年, 国际纯化学与应用化学联合会(IUPAC-IUB)将GHb定义为非酶促的Hb的糖基化, 是人体内由葡萄糖修饰而形成的一种稳定的Hb形式[1]。根据侧链上所连接成分的不同加以区分, 各组分命名见表1。  三、检测GHb的临床意义 测定GHb可用于了解一段较长时间内的血糖水平, 并可作为评价治疗效果的一项指标。所以从20世纪80年代起逐渐被临床广泛应用, 成为判定血糖长期控制情况的良好指标。 1985年, 美国进行了著名的为期9年的糖尿病控制和并发症临床试验(diabetes control and complication trial, DCCT)。与此同时, 英国也进行了著名的糖尿病前瞻性研究(UK prospective diabetes study, UKPDS)。这些研究分别将GHb中的HbA1c作为观测指标[2, 3], 证实了血糖控制与糖尿病慢性并发症发生、发展的危险性之间的关系。研究结果表明, 良好控制血糖(通过定量检测HbA1c)可以大大减少糖尿病并发症(视网膜病变、肾脏损害、血管病变等)的发生和发展。HbA1c 每降低 10%(例如 12%下降至10.8%, 或 8%下降至7.2%), 糖尿病慢性并发症的危险性降低45%[2]。 依据DCCT结果, 美国国家卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)、美国糖尿病学会(American Diabetes Association, ADA)和其他专家组建议[4]:对所有糖尿病患者治疗时, 应该使血糖控制到正常水平, 以减少并发症。为了解血糖的控制程度, 糖尿病患者应常规定期进行 GHb 检测, 血糖稳定的患者每年至少测定2次HbA1c, 调整治疗方案或血糖控制未达到要求的患者每 3个月至少测定1次HbA1c。ADA同时推荐所有糖尿病患者必须将GHb控制在7%以下(非糖尿病的参考范围为4%~6%); 超过8%的患者应该考虑需要有进一步的治疗措施。值得注意的是这些建议均建立于DCCT的基础之上, ADA建议HbA1c 测定方法得到的值应具有可溯源性, 应与DCCT的方法具有一致性。 四、GHb的检测方法和检测标准化 GHb的检测方法众多, 大多是先检测全血中总的Hb, 然后以各种分离技术检出GHb, 再以GHb在总Hb中的比例表示结果。目前临床实验室使用的方法超过15种, 分别采用了离子交换层析、免疫学方法、亲和层析、电泳和比色分析等方法原理[5], 其中前3种方法的应用更为广泛。1995年美国病理家协会(CAP)调查显示应用最多的方法为亲和层析法(约占总数的54%)。2007年CAP调查显示亲和层析法所占比例下降, 免疫比浊法检测GHb成为主流(约占总数的65%)。 不同的检测方法原理各异, 检测报告对象及抗干扰能力也各异, 见表2。  GHb测定值的不一致影响了其临床应用[6]。1993年美国临床化学协会(AACC)成立了GHb的检测标准化委员会。试图以DCCT的方法为标准统一GHb结果, 使各方法间具有可比性[7]。1996年美国国家GHb标准化计划(National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP)接替了AACC标准化委员会的工作[8], 10多年来在GHb的检测值的一致性方面取得巨大成功。 NGSP由指导委员会和实验室网络组成, 实验室网络包括一级中心参考实验室(CPRL)、一级参考实验室(PRL)和二级参考实验室(SRL), NGSP实验室网络对生产厂商和检测实验室的指导管理方法包括校准、认可、比对三方面。NGSP 对各种GHb检测方法和试剂定期进行评定, 认可合格的有效期为1年, 并在网上公布详细数据(http://www.), 内容包括生产厂商、检测方法和仪器、换算公式、认可日期、试剂批号、校正品批号和定值、认可的参考实验室等。CAP每年采用新鲜血样本进行2次GHb的室间质评调查。调查显示美国采用NGSP认可方法的实验室逐年增加, 实验室报告结果也有较大改变。见表3。  2009年, 在CAP 的GH2-a调查中已不再考虑不同方法组的均值, 采用NGSP认可的方法的检测均值与 NGSP 的 HbA1c 靶值的差异分别为0.3%(低值)、0.4%(中值)和 0.5 %(高值), 大部分(约95%)实验室方法之间的变异系数(CV)≤ 5.0 %; 总的符合率为95.2%~97.1%。2009年可接受标准为 NGSP 靶值的± 10%(2008年为± 12%), 2010年要求达到± 8%, 2011年将要求达到± 6%, 虽然NGSP在GHb检测一致性中取得极大进展, 但此计划根本上是以DCCT中的方法为标准。DCCT中采用的高效液相色谱(HPLC)法检测HbA1c虽然精密度较好, 结果长期稳定, 但存在检测特异性问题。1995年, 国际临床化学和实验室医学联盟(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, IFCC)设立HbA1c标准化工作组, 开始了HbA1c标准化工作。2002年IFCC正式推荐HPLC-质谱(MS)法或 HPLC-毛细管电泳法(CE)法作为检测 HbA1c 的参考方法, 并将纯化的HbA0和HbA1c混合物(6水平)作为参考物质。由于IFCC方法更为特异, 其检测结果较NGSP有较大差异(见表4), 但一定范围内相关良好, 可通过NGSP = (0.915 × IFCC) + 2.15的公式进行转换[5]。  2002年, IFCC方法初步确定的参考范围为 3.33%± 0.48%( x?± 2s); 第97.5百分位值为3.8%。与DCCT的结果存在一定差异(低1.5%~2.0%)。这一参考范围是否随新的参考系统被采用或者仍保留目前广泛使用的可溯源到DCCT的参考范围, 这一重要问题仍需国际间的意见一致和共同努力[19]。 采用IFCC的HbA1c范围, 优点在于检测值反映了实际浓度, 有助于糖尿病专业医务人员和患者了解HbA1c检测的知识和意义。而NGSP已为医生和患者熟知, 且被临床试验所证明(NKPDS和DCCT)。如果采用IFCC方法可能首先需要耗费相当数量时间和金钱来帮助人们重新认识HbA1c, 一段时间内检测实验室之间的差异可能会增大, 检测结果数字的变小会使患者对变化的认识不足导致存在血糖控制不良的风险。当然继续采用NGSP方法也有一定的不利之处, 它的检测值不是真正的浓度, 同时也会错失改进检测方法的时机[9]。 2002年国际糖尿病协会(IDF)、欧洲糖尿病学会(EASD)、美国糖尿病学会(ADA)和IFCC达成共识, 认为目前应采用 IFCC 参考方法作为新的全球标准为HbA1c 生产厂商定值; 国际参考实验室网络的确认程序采用 IFCC 方法; 在其他工作未完成之前, 生产厂商目前可继续沿用 DCCT/UKPDS 的数值, 暂不改变 HbA1c的测定值。今后3年的主要任务是确认血糖值与 HbA1c 的关系, 尤其是在2型糖尿病中的应用价值; 进行前瞻性研究确认不同人群中血糖值与HbA1c的关系; 计划对公众和专业人员进行新的检测方式的宣传教育[9]。 2002年IDF、EASD、ADA再次共同确认[21]HbA1c 检测(包括参考检测系统和测定报告值)应全球标准化, 只有当实现检测标准化后, IFCC的HbA1c参考检测系统才有价值。HbA1c 检测结果的单位应采用IFCC单位(mmol/L)和采用IFCC-NGSP换算公式的NGSP单位[10]。 五、 GHb推导的平均血糖浓度的研究 美国糖尿病学会(ADA)、欧洲糖尿病研究学会(EASD)和世界糖尿病协会(IDF)发起并成立了HbA1c推导平均血糖浓度(A1c-derived average glucose, ADAG)工作小组。希望通过观察HbA1c和平均血糖(average glucose, AG)之间的关系, 得出HbA1c 与AG之间的数学换算公式, 估算的AG(estimated average glucose, eAG)与日常监测血糖值的单位一致。并可通过HbA1c测定值推算得到AG值用于临床解释。 多中心的ADAG实验的初步结果于2008年发布[11], 人群选择来自喀麦隆、丹麦、意大利、挪威、美国、印度(因样本原因而最后除外), 通过糖尿病类型、HbA1c 水平和年龄、性别和人种进行分组。采用 MiniMed 连续监测血糖(CGM), 每 5 min 测1次, 连续监测至少 48 h, 然后的 12 周每 4 周测1次; 在 CGM的2 d采用 HemoCue meter 监测血糖, 每天测 8 点(餐前、餐后 90 min、睡前和凌晨3时); 在 CGM 不监测时采用 One Touch Ultra meter, 每周至少3 d, 每天测7点(餐前、餐后 90 min、睡前), 持续整个实验。CGM 平均每例检测约2 400次, 血糖仪平均每例检测约300次, 合计3个月内平均每例检测约 2 700次。中心实验室采用 DCCT 认可的4种方法(2 种液相色谱法、2 种免疫方法)检测 HbA1c 基础值, 然后每月1次, 分析最后1次HbA1c检测值与近 3 个月的血糖值的关系。结果显示HbA1c与AG浓度之间呈显著相关(图1), 且与个体间差异无关。该实验结果支持以eAG的方式报告HbA1c的结果, 并建议以此方式报告HbA1c, 为临床提供有效的诊疗信息。  然而此实验本身依然存在一些值得重视的问题:实验中使用的血糖仪其方法学固有的不足制约了其检测准确性; 方程推导的结果是否与常规化学的结果相适应?实验中相同HbA1c结果个体其AG浓度之间存在差异, 这一差异是否由检测差异、个体间差异、相关方程的不完美或红细胞生存周期及基因差异导致的糖基化过程不同而引起?未选择亚洲人群, 方程是否适应中国、印度这2个糖尿病大国?无相应儿童、孕妇数据?人群选择血糖控制稳定的人群, 血糖控制不稳的糖尿病患者是否适用?除此之外, 也有报道认为AG(DCCT样本)与 HbA1c 关系并不呈恒定相关[12]。这些问题期望着进一步的实验加以阐明。 尽管如此, 报告eAG依然可能是今后HbA1c检测的一个重要趋势, 各学术组织均一致赞同在报告HbA1c结果的同时报告eAG(mmol/L或mg/dL), 并将在全球范围尽快完全实施。ADA将开展一个教育计划以教育临床及患者, 教育计划也包括成立eAG转化委员会以推进此事。 六、 HbA1c 6.5%— — 糖尿病的诊断指标 糖尿病长期以来使用血糖作为诊断指标, 1979年美国糖尿病数据管理组(National Diabetes Data Group, NDDG)在葡萄糖人群分布的基础上, 提出了糖尿病的诊断标准[13], 此标准为世界卫生组织(WHO)所采用, 沿用长达20余年[14]。但此标准的设立仅以表面健康人群为基础, 并未与糖尿病的并发症相联系, 故1997年有关专家组成了糖尿病分类及诊断执行委员会(Expert Committee on Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus)[15]。以视网膜病变的发病率作为考量指标, 综合了印度(960例)、美国(2 821例)、埃及(1 018例)大样本人群, 综合分析, 下调并重新设立了糖尿病的诊断标准[16], 此标准再次被WHO所采纳[17]。 HbA1c之前并未被选为诊断指标的重要原因是检测缺乏标准化, 诊断判断值不明。随着标准化的进展, 选择HbA1c作为糖尿病诊断标准正逐渐为临床社团、学会及学者所考虑。最近, 国际专家委员会(International Expert Committee)总结了HbA1c作为诊断指标优于血糖的几个方面包括:(1)HbA1c可标准化并溯源至DCCT及UKPDS, 而血糖检测标准化相对较差; (2)是高血糖及长期并发症危险的更好指标; (3)生物学变异小; (4)分析前更稳定; (5)无须空腹或限时样本; (6)相对受血糖水平急性变化干扰小(压力或疾病状态); (7)目前已作为糖尿病管理和治疗监测的标志物[18]。 HbA1c诊断判断值的确立参用了1997年的方法, 以非增生的视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR)的流行率作为考量, 分析选用了DETECT-2的试验人群[19]及1997年时所选用的相关人群, 总数达28 000例受试者, 包括9个国家, 结果见图2。  多样本、多人群的实验结果均将HbA1c水平与中度上升的视网膜病变发病率相关联, 证明了HbA1c临床判断水平设定6.5%可作为糖尿病的诊断标准。当然机械的将这一决定水平绝对化, 增之则病, 减之则健, 这样是不合理的。然而HbA1c 6.5%能够有效的揭示出视网膜病变风险并诊断为糖尿病这一点是毫无疑问的。 2009年ADA国际专家委员会推荐糖尿病可通过HbA1c 6.5%来进行诊断, 诊断需通过重复检测来证实, 无需要求血浆血糖水平> 200 mg/dL(11.1 mmol/L)。如果无法检测HbA1c, 之前推荐的诊断实验同样可行(例如空腹或2 h血糖)。在儿童糖尿病中, 存在糖尿病典型症状但随机血糖< 11.1 mmol/L的疑似患者中建议检测HbA1c。建议即时检验(POCT)的结果不应用于糖尿病诊断[20]。 当然HbA1c应用于糖尿病的诊断依然存在较多的不同意见(如铁缺乏及血红蛋白病等疾病中的应用), 且HbA1c诊断限值的最终确立仍需讨论[21]。ADA目前正广泛征求意见, 最终可能于2009年下旬颁布基于HbA1c的诊断导则[20]。最终这一方式是否适合于我国人群, 还需要更多临床实践的验证。 参考文献 [1] Peterson KP, Pavlovich JG, Goldstein D, et al. 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