真菌发酵生产天然脱落酸的新方法

专利名称真菌发酵生产天然脱落酸的新方法
技术领域本发明属于用真菌发酵法生产天然活性脱落酸的发酵工程。
脱落酸(Abscisic Acid，简称ABA)是目前世界上已发现的五大植物荷尔蒙之一。天然型的ABA由于对农作物的生长发育具有很强的调控活性，能促进果实类、谷类、豆类的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和耐盐能力，因而具有广阔的应用前景。目前，ABA在基础领域的研究已深入到植物细胞与基因工程水平。然而，由于存在于植物体内的天然活性ABA光学构型仅为(S)-(+)-ABA，单纯的(S)-(+)-ABA的生产成本极高，售价昂贵，而人工合成的ABA，得到的是Racemid型，活性远小于天然型的ABA，因此，ABA应用于农业生产几乎是空谈。为了解决和满足ABA应用于农业生产的问题，近二十年来，国外开始利用微生物发酵法来生产天然活性脱落酸。1977年，意大利G.Assante首先采用Cercospora Rosicola发酵生产天然活性脱落酸，主要为固体发酵，但由于其产量很低，其商品价格很高(193.4美元/毫克)，1982年，日本的丸茂晋吾发现利用真菌Botrytis Cinerea可生产天然活性ABA，并申请了专利，其后，于1987，1988，1990年，日本东丽公司和新日本化学工业公司的松本俊一等、相继用Botrytis菌株生产天然活性脱落酸，申请了六项专利，生产工艺分别为固体发酵，也育液体摇瓶发酵，同时采用了纤维素泡沫作载体的液体发酵，发酵产量已由15-20mg/升培养基提高到23.8-85mg/升发酵液，最高的产量已达300mg/L。但以上的专利还存在①发酵产量低；②发酵工艺尚局限于固体发酵和液体批次发酵，没有充分利用菌体连续产生脱落酸的特性。菌体在一个固定的培养环境中生长，产酸，当产物(脱落酸)达到一定浓度时，产生抑制作用，菌体不再分泌产物，造成营养物质、菌体和能源的浪费，使产量不能提高，生产效率低，成本高。仍然不能解决应用于农业生产上的问题。
本发明的任务是寻找一个能大幅度提高脱落酸产量的新工艺，大幅度降低脱落酸的生产成本，使工业化规模生产成为可能。
本发明的技术解决方案1.改造现有的脱落酸产生菌株为高产菌株，大幅度提高菌种的发酵活性。
2.改液体批次发酵工艺为固定化菌体连续流加补料、出料、PH控制的(起始PH控制、生长期PH控制、生产期PH控制、发酵终了期PH控制)发酵工艺。
3.选择更适合于菌体生长、产酸的培养基配方。
4.通过添加关键底物、周控菌体发酵的代谢途径，大幅度提高脱落酸产量。
本发明使用的菌种为Botrytis Cinerea-Cercospoxa RosicolaFD338(简称B.C.FD338)。该菌是用葡萄孢霉属菌株Botrytis CinereaT-1进行原生质体诱变后再同另一脱落酸产生菌Cercospora Rosicola216进行原生质体融合及相关遗传诱变处理所获得的高产脱落酸菌株。
本发明采用三级连续发酵，根据三级不同要求，选择了三种不同的培养基A、B、C。其组成为培养基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％ 酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麦芽汁5-20％ 玉米浆0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％
甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％ MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培养基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)废糖蜜0.5-7％(或纤维二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆饼粉0.1-2％(或花生饼粉0.1-2％，或棉籽饼粉0.1-3％)谷氨酸0.01-0.5％，(NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培养基C糊精0.1-3％麦麸汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或废糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽饼粉0.1-2％(或豆饼粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生饼粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纤维二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或柠檬酸钠0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％
FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、钼、钴、镍等微量元素(0.1-100μmol/L)本发明的发酵过程为将活化后的菌种接种于培养基A中，在三角瓶内摇瓶培养24-72小时后，以5-10％的接种量接种于已放有培养基B的种子罐中发酵培养24-60小时，然后仍按5-10％的接种量接种于三级发酵罐中进行发酵。三级发酵罐以培养基C作为发酵营养液，并于罐体中加入微孔陶瓷材料，(或微孔网膜、煤渣、聚氨酯泡沫，砖渣或海藻酸钠，聚乙烯醇、明胶等)将菌体固定化处理。在三级发酵过程中，待菌体生长进入稳定期时，通过降低溶解氧浓度、降低发酵温度手段降低菌体生长速率，并连续低浓度流加培养基C及添加前体底物，定时定量出料。将发酵后的发酵液用有机溶剂萃取法，离子交换柱法，硅胶柱层折法及活性炭吸附法等提取后，即得白色纯品脱落酸。
在发酵系统添加的前体底物主要有咪唑，吗啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺、乙酸胺，β.β-二甲酰酸，咾啉，甲羟戊酸中的任一种。
提取过程中所用的试剂为甲醇、乙醇、乙酸乙脂、丙酮、氯仿、乙醚、环乙烷，石油醚等低级醇。离子交换柱所用的树脂为强碱阴离子树脂，也可为大孔树脂。发酵条件温度10℃-40℃ PH3-12PH调控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式进行发酵时间1-30天，前体底物添加量0.1-16％本发明的整个工艺流程见附图
。
本发明的优点①生产菌种的产量较目前国内外报道的最高产量高3-4倍(日本专利最高为300mg/L发酵液，本菌种B.C.FD338产量为900-1200mg/L发酵液)；
②发酵系统采用固定化技术，避免了菌体在连续进料出料过程的流失，使产酸量稳定；③发酵系统在产酸期能稳定10-30天，从而大大提高了生产效率，降低了能耗和原料使用量，使生产成本大幅度降低。
④关键前体底物的添加，促进了发酵代谢正向顺利进行，大幅度提高了产量。
实施例用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后，接种活化后的B.C.FD338菌孢子悬液，置于25℃-28℃温度下的摇床上，摇瓶培养24-72小时。
将培养好的一级种子液按5％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中，在24-28℃温度下通气搅拌培养24-60小时。
用1吨发酵罐作三级罐发酵。罐内装培养基C750立升及微孔陶瓷珠(粒径0.9-160mm3，1.0-5g/L)，用常规高压热蒸气灭菌后，按5％接种量接种二级种子液，通气搅拌48小时，然后通入氨将PH控制在4-8，降低溶解氧浓度(降低通气量)，降低发酵温度至10-25℃以0.01-5L/小时的速度流加培养基C，以0.1％-16％的比例加入甲羟戊酸，使发酵系统状态稳定，每隔10小时出料一次。将所出的液料以离子交换树脂法回收发酵液中的产品，并用乙醇洗涤，得白色结晶状脱落酸产品。旋光度[α]D28＝+419°。
经检测发酵系统经过25天的稳定产酸，产量可达1.2克脱落酸/升发酵液。经离子交换法回收，产品回收率达80％。
权利要求
1 用真菌发酵生产天然活性脱落酸的新方法，其特征发酵采用三级连续发酵，真菌固定化工艺。在第三级发酵过程中，通过控制营养成分(流加培养基C)、控制溶解氧浓度、温度、PH等来稳定产酸量，并定时定量出料。提取工艺采用有机溶剂萃取，离子交换，柱层析及吸附法。整个工艺流程见附图。
2 按照权利要求1所述的真菌发酵生产天然活性脱落酸的方法，其特征是三级连续发酵的培养基分别为一级培养基为A，二级培养基为B，三级培养基为C，其组成为培养基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麦芽汁5-20％ 玉米浆0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培养基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)废糖蜜0.5-7％(或纤维二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆饼粉0.1-2％(或花生饼粉0.1-2％，或棉籽饼粉0.1-3％)谷氨酸 0.01-0.5％ (NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培养基C糊精0.1-3％ 麦麸汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或废糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽饼粉0.1-2％(或豆饼粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生饼粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纤维二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或柠檬酸钠0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、钼、钴、镍等微量元素0.1-100μmol/L
3按照权利要求2所述的真菌发酵生产天然活性脱落酸的新方法，其特征是一级种子接种于二级种子，二级种子接种于三级发酵罐，其接种量均为5-10％。
4按权利要求1或2所述的真菌发酵生产天然脱落酸的新方法，其特征是用于固定真菌的材料为微孔陶瓷(或海藻酸钠，聚乙烯醇、明胶、微孔网膜，煤渣砖渣，聚氨酯泡沫等)。
5按照权利要求3所述的真菌发酵生产天然脱落酸的新方法，其特征是三级发酵系统中添加的前体底物主要为咪唑，吗啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺，乙酸胺，β、β-二甲酰酸，咾啉，甲羟戊酸等中的任一种，添加量为0.1-16％。
6按权利要求1或5所述的真菌发酵生产脱落酸的新方法，其特征是提取工艺中，所用的洗脱剂为低级醇类。
7按权利要求2或4所述的真菌发酵生产天然脱落酸的新方法，其特征是发酵条件为温度10℃-40℃，PH3-12，PH调控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式进行。
全文摘要
本发明属于用真菌发酵生产天然活性脱落酸的新方法。本法通过改造现有脱落酸菌,改变培养基配方,改液体批次发酵工艺为连续流加补料出料以及采取菌种固定化、添加关键底物使产酸量稳定,从而大幅度提高产量,降低了能耗和原料的使用量,大幅度降低了生产成本,使工业化规模生产成为可能。
文档编号C12P7/40GK1182798SQ9611778
公开日1998年5月27日 申请日期1996年11月18日 优先权日1996年11月18日
发明者谭红, 李志东, 丁立生, 彭树林 申请人:中国科学院成都生物研究所