用于鉴定多种微生物的通用检测系统和方法

专利名称用于鉴定多种微生物的通用检测系统和方法
技术领域本发明涉及用于鉴别微生物的通用检测系统和方法，此微生物可能属于多个不同群，例如如下来自不同族群微生物中的任何一种厌氧菌，酵母菌，在合成培养基上不易生长的细菌，肠道菌，葡萄球菌，链球菌，和肠道球菌。本发明的检测系统包括一套预定的试验，用于检测某科或群，属和/或种微生物特异性酶的存在。
背景技术自从微生物学科开始确立以来，发展细菌分类或鉴别的方法始终是微生物学界一贯的追求目标。早期分类法是基于对微生物的显微镜观察，并继而描述它们细胞形态，即球形细胞，杆(棒)状细胞，球一杆形细胞，出芽酵母，和螺旋形生物(Sphirochytes)，微生物学家还对微生物细胞的排列方式进行描述，作为微生物分类的补充手段，即链球菌是显得象一串珍珠似的成串的球形细胞，葡萄球菌是一串象葡萄似的球形细胞等。尔后，染色技术的发展增强了显微镜的鉴别能力。其中最重要的是革兰氏染色，它把微生物分为二类革兰氏阴性微生物被染成粉红至红色，革兰氏阳性微生物被染成淡兰至兰色，继而观察到，在引起人疾病的微生物中，绝大多数革兰氏阴性微生物是杆形的，而绝大多数革兰氏阳性微生物是球形的。另一种早期区分微生物的方法是，确定微生物在存在或不存在氧时的生长能力。存在氧时生长的微生物被称为需氧微生物，不存在氧时生长的被称为厌氧微生物。
诊断微生物学中较重要的早期发现之一是，可以用不同类型的液体或固体细菌生长培养基，使细菌生长在试管或平皿中。此后微生物学家开始将各种不同的化学物质加入到生长培养基中，建立了鉴别微生物的另一种方法，例如，生长或生长抑制试验，如6.5％NaCl抑制链球菌生长，但是不抑制肠道球菌生长，或者生化试验，例如肠道菌可发酵葡萄糖产生酸性最终产物，而非发酵菌不能。
将所有上述的形态学，生长/抑制，以及生化试验结合起来，形成一套微生物学家可用于鉴定细菌的测定法，导致构成了可将细菌分类为用于对所有生物进行分类的传统的科、属、种分类学单位。历史上微生物学家的探索建立了多种仅适用于一群或一科微生物的分类测定法，例如鉴别绿毛链球菌的Facklam氏法(参考文献3)，鉴别凝固酶阴性链球菌的Kloos and Schleifer氏法(参考文献2)，鉴别革兰氏阴性肠道菌的Edwards和Ewing法(参考文献1)，等等。这些方法的每一种，使用特定设计针对该方法选定微生物种类代谢和生长特点的试验组合。因此，对链球菌的葡萄糖发酵试验，不同于对葡萄球菌和对肠道菌的葡萄糖发酵试验。实际上，配制细菌培养基的厂商是以商业为基础提供上述种类特异性的配方。Remel(12076 Santa Fe Drive Lenexa,Kansas 66215-3594)目录号103(1994年1月)为微生物学家提供了广泛多种常规的生化测试管配方，用于完成上述参照性鉴定方案。Remel商品目录专门提供了8种不同配方的培养基，用于检测7个不同族微生物的糖类发酵，它们包括如下紫色液体培养基(PurpleBroth)，用于检测肠道菌(见P40-41)，酚红液体培养基，用于检测链球菌(见P38-39)P.R.A.S.培养基和CHO培养基，用于检测厌氧菌(见P29-30，和40),CTA培养基和心肌浸汁液体培养基，用于检测在合成培养基上不生长的微生物(见P30-31，和33)。OF培养基，用于检测非发酵性革兰氏阴性杆菌和肠道菌(见P37-38)，以及酵母菌发酵液体培养基，用于检测酵母菌(见P47-48)。
参考文献1.Ewing,W.H.1986，“肠道菌的Edwards和Ewing氏鉴定法，第4版，Elsevier Science Publishing Co.New york。
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3.Facklam,R.R.and J.A.Washington Ⅱ,1991，“链球菌及相关的过氧化氢酶阴性的革兰氏阳性球菌”，P238-257，见A.Barlows,W.J.Hausler,Jr.K.L.Herrmann,H.D.Isenberg,and H.J.
Shadome(ed)，临床微生物学手册，第5版，American Society fbrMicrobiology,Washington DC。
从二十世纪60年代后期开始，随着Roche Diagnostic(1447 YorkCourt,Burlington,NC 27215)引入肠道菌鉴定系统(EnterotubeIdentification system)用于肠道菌，紧接着API(595 Anglum Drive,HazelWood,MO 63042-2395)推出了20E肠道菌鉴定系统(20EEnteric Identification System)，检定公司开始采用与此相同的原理，开发和制造商品细菌鉴定试剂盒。Vitek,MicroScan,IDS(InnovativeDiagnostic Systems,2797 Peterson Place,Norcross,GA 30071)，和API等，都提供了鉴别细菌各族群的族特异性产品(见下面表1)表Ⅰ
探索历史使微生物学家认识到，对属于不同细菌族的临床微生物分离物或菌株的鉴定，需要使用不同设计的常规生化测试管或不同的商品。所有传统的生化测定法都依赖于生长培养作为扩增细胞数量和诱导某些酶的手段。必须针对各个细菌族的生长特征使检测方案最优化，这种要求正是使族特异性测定法(传统的生化测试管或商品试剂盒)成为历史热点的基础。例如，在上面论述的常规生化测定法中，存在8种不同的葡萄糖发酵配方，它们被配制与7个不同族的微生物具有特异性反应活性，因为常规的生化测定法在很大程度上是生长依赖性的，所以每个葡萄糖发酵反应，对特定微生物族的生长，以及对该族微生物葡萄糖发酵的检测都是最优化的。商品生化鉴定系统推进了这种实践过程，对每个不同族群的微生物存在不同的生化鉴定产品(见上面的表格)。开发群特异性产品种类，既是需要发展各种配方，以便支持族群特异性生长特征的反映，也是优化底物对各族群微生物代谢的反应性需要的反映。在各检定公司开始利用生色反应，发荧光反应，或者利用比色或荧光测定的快速常规测定法，发展快速鉴定检测时，仍继续采用了族特异性的格式，虽然对生长的依赖性大大减少了。这些新型的快速鉴定系统确切说是与生长无关的，而不是生长依赖性的。与用于基于生长的系统相比较，它们是测定存在于更浓的细菌悬液中预先形成的酶。
因此，理想的是有一个通用的检测系统，可用于分类和/或鉴定属于完全不同的多群微生物中任何一种微生物，例如通过使用一套生化试验，避免使用多套试验或商品检测试剂盒，其中每套试验或每种组合是针对特定的微生物族群所特制的。
发明概述本发明首创用一套各具有单独通用配方的生化试验，能够鉴定属于完全不同微生物群的任何一种微生物。这种“通用的”形式包括几个通用的生化鉴定系统，它在短至15分钟的孵育时间内，或者在8小时内(一个单独的工作班次)产生鉴定结果。这些测定法性质上可能是生色反应/比色测定法，或者是荧光发生/荧光测定法，并且可能是肉眼可视的，或者是自动化测定的。用于分类和鉴定微生物的数据库(机率模型)包括，或者是含有所有待检定族各成员的单一数据库，或者是一系列对每一族微生物特异性的次级数据库。这种机率模型在下文有时指的是一个预定的标准。对使用者本系统的一个优点是，对于大多数他们需要鉴定的微生物，他们只需要学会如何使用单独一种测定方法。其次，对于大多数他们需要鉴定的微生物，使用者只需要编制调整一个检定试验，而不需要管理多成分的程序。
本发明涉及一套(通用的)生化测定法，即检测系统，可用于鉴定属于多个完全不同微生物群的任何一种微生物。要在这些明显差异的群中对其中一种特定微生物进行分类，主要是根据那些特定的微生物对生长的要求。例如，葡萄球菌，链球菌和肠道球菌具有同肠道菌和非发酵菌类似的生长要求。在过去，是通过在特别适合于各族群微生物的已知生化配方中(例如，对酵母菌，厌氧菌，或在合成培养基中不易生长细菌的特异性生长的培养基)观察其生长情况，来检测不同群的微生物。完全不同族群微生物的例子包括(ⅰ)酵母菌和厌氧菌，(ⅱ)酵母菌和葡萄球菌，链球菌和/或肠道球菌，(ⅲ)酵母菌和肠道菌，(ⅳ)酵母菌，厌氧菌，和在合成培养基中不易生长的细菌，(ⅴ)在合成培养基中不易生长的细菌和酵母菌，以及(ⅵ)厌氧菌和在合成培养基中不易生长的细菌。非特异性族群微生物的例子包括例如，(ⅰ)肠道菌和非发酵菌，(ⅱ)葡萄球菌，链球菌，和肠道球菌，以及(ⅲ)奈瑟氏菌属和嗜血杆菌属。
属于这些完全不同群的各类微生物例子可在下面表Ⅱ至表Ⅴ中看到。微生物的这些群在经常补充和删除，并且以一种替换另一种，或者被给予新的名称。本发明的检测系统适用于所有这些群。
表ⅡHNID菌群
表Ⅲ酵母菌群
表Ⅳ革兰氏阳性群
表Ⅴ厌氧菌群
本发明的方法包括使样品经受一套预定的生化试验，检测微生物代谢途径中是否存在某微生物科、属和/或种特有的至少一种酶和/或几组酶，以便对此微生物进行鉴定。一套试验在下文有时被称为试验组合或检测系统。在此使用的样品包括来自生长在选择性或非选择性培养基上菌落的微生物悬液，最优选的是基本纯培养物的悬液。
本发明的检测系统包括许多实行生化测定的反应小室，其中每个反应小室内含有针对至少一种酶的底物，其中的底物如果受酶的作用，将在反应小室内形成可检测的产物，并且，试验组合中的这些可检测的产物与样品中微生物的鉴别相关联。
在优选的实施方案中，反应小室是分布在一片盒卡内，例如微量滴定板，在此被称为“卡板”。卡板中反应小室的数目可根据特定的用途改变。反应小室根据需要可以是开放的或被复盖的。
这样，一方面本发明提供了一个通用的检测系统，以及使用该系统的方法，形成了一套预定的生化试验，用于鉴定属于完全不同的多群微生物的任何一种微生物。优选地该微生物可被分类至独立的属，更优选地可被分类至种。
在一个优选的实施方案中，该通用的检测系统包括至少一片卡板，其中配置有许多反应小室，例如反应小池，小池中含有至少一种酶的底物和其它测定成分。在一个优选的实施方案中，是通过使用单独一片通用检测卡板来完成一组预定的生化试验，此卡板含有最多达到大约60个反应小室，更优选地是大约36-48个反应小室。在特别优选的实施方案中，反应小池在测定卡板上是排列成直线，以便于采用优选的半自动或全自动的采样、检测和数据处理技术。
一般来说，可通过应用已知的统计学技术，来选择一套适合用于本发明通用检测系统的生化试验，以便选定一套能够鉴别所需多种微生物的试验。然后构建不同的数据库。再用已知的统计学技术评价各套不同的数据库。在下文实施例3中描述了一种这样的统计学技术。用于鉴别微生物的数据库(机率模型)或预定的标准包括，或者是包含所有待鉴定群各成员的单一数据库，或者是一系列对每一群微生物特异的次级数据库。如前面所术，此系统对使用者的主要优点是，对于大多数他们需要鉴定的微生物，他们只需要学会使用单独一种测定方法，并且，对于大多数他们需要鉴定的微生物只需要编制调整一个检定试验，而不需要管理多成分的程序。
在上述实施方案中，单一数据库或一系列次级数据库，即机率模型，是被用作预定的标准，通过将样品测定系统(卡板)的结果与此标准作比较而对微生物进行鉴定。见实施例3。优选地是，该预定的标准是从用分光光度技术或荧光测定技术得到的数据而形成的。但是，该预定的标准也可以使用通过目测比色测定得到的数据来确定。
用于鉴定微生物各种酶的多种生化试验都是本领域熟知的。这些测定法的大多数都适合用于本发明的通用检测系统。
本发明的通用测定系统包括基于荧光的测定法或基于比色的测定法，或者是它们的某种结合形式。例如，在本发明的通用检测系统中，对于某些试验优选地是采用基于荧光的测定法，因为它比基于比色的(生色反应的)测定法有较高的灵敏度和速度。但是，对于该通用检测系统中的其它一些试验，优选地是采用基于比色的测定法，因为它比较方便，例如，对测定结果的可视性判断。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，该通用检测系统通过使用一套其中大多数试验是基于荧光的预定的生化试验，能够鉴定多种微生物。在此实施方案中，是通过检测某种荧光可测定产物的存在，来检测某一途径中几种酶和/或几组酶的存在。在某些情况下，荧光产物的生成是通过酶与底物反应引起pH改变的结果(荧光测定)。在另一些情况下，荧光产物的生成伴随着生荧光底物的断开(例如水解)，形成可检的衍生物荧光团，通常表现出荧光增强(荧光生成测定)。还有另一些情况是，生成猝灭荧光指示剂的生色产物。
为了鉴定样品中的微生物，从一套预定的试验中得到的结果，将经受多种统计学方法检验，即同至少一种预定的标准相比较。见实施例3。
在一个优选的实施方案中，可检测的荧光产物是在预定的一套试验中的一个或几个试验中形成，通过断开至少一个荧光底物(例如通过水解)生成衍生的荧光团，随之增强荧光。在本通用检测系统的一个特别优选的实施方案中，酯酶、肽酶和糖苷酶试验都优选地以荧光生成方式进行。
在另一个优选的实施方案中，一个或几个生化试验中的可检测性荧光产物，是在酶反应存在下，由荧光指示剂形成。一般是，该荧光指示剂是能够显示荧光改变的pH反应性化合物。特别是，在发生pH增加(碱性化)或pH降低(酸性化)时，该荧光指示剂显示出荧光增强。在本通用检测系统的一个特别优选的实施方案中，糖发酵酶、脲酶、脱羧酶和碳素利用酶试验都是以荧光测定方式进行。
本发明还首先以荧光测定方式提供了碳素利用酶试验。在此实施方案中，这种酶试验包括针对碳素利用酶的至少一个底物，以及至少一个荧光指示剂。碳素利用酶，如果存在的话，作用于底物，引起pH改变，导致从荧光指示剂形成荧光产物。
在某些实施方案中，本发明的通用检测系统包括至少一种基于比色测定的生化试验。比色测定可以是荧光检测试验的补充或替代方式。在某些情况下，生色产物的形成是酶与底物反应而引起pH改变的结果(比色测定法)。比色测定指示剂一般是能显示颜色改变的pH反应性化合物。特殊情况下，生色指示剂是在pH增加(碱性化)或降低(酸性化)时发生颜色改变。在另一些情况下，生色产物的形成是伴随着生色底物的断开(例如通过水解)，生成可检测的衍生物生色团。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，该通用的测定系统包括用于检测肽酶和糖苷酶每一种的至少一种试验。在其它一些优选实施方案中，该检测系统还进一步包括糖发酵酶试验。在另一些优选的实施方案中，此测定系统还进一步包括用于检测脲酶、脱羧酶、酯酶、色氨酸酶(吲哚测定)或碳素利用酶的至少一种试验。在卡板式检测实施方案中，通用测定卡板上预定数量的小池中，配备有测定每种酶的至少一种底物，以及测定所必须的其它成分。使用时，将样品加到每个小孔中，如果样品中存在某种酶或某组酶，就作用于此底物，生成可检测性产物。如果每种试验中存在某种酶或某组酶，可通过鉴别每个孔中可检测性产物来测定，其中来自几种试验组合的可检测性产物，通过同预定的标准相比较，与样品中某种微生物的存在相关联。
在其它的优选实施方案中，补充试验包括磷酸酶试验。对于补充的酶试验，可以按需要以生色测定或荧光发生方式进行。
在一个特别优选的实施方案中，这种通用的测定卡板中包含一套预定的生化试验，其中包括对肽酶、糖苷酶、糖发酵酶、酯酶和碳素利用酶每一种的荧光测定法，以及对脲酶，磷酸酶、色氨酸酶和脱羧酶的至少一种比色测定法。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，该通用检测系统包括一套在大约10分钟至8小时内，优选地在大约10分钟至2.5小时内完成的预定的生化试验。虽然按照现有的方法，绝大多数生化试验可以在大约2小时内完成，但是，在某些情况下，理想的是延长测定时间至大于3小时，达到约8小时。例如，在某些情况下，测定时间大于2小时是用于增强对表现缓慢催化速率的低水平酶的检测。在另一些情况下，测定时间小于2小时是用于检测含量丰富的酶或高催化速率的酶。
还有另一方面是，本发明提供了用于快速检测或鉴定样品中各种酵母菌的基于荧光的测定法，例如引起疾病的酵母菌(如念珠菌)。
还有另一方面是，本发明提供了基于荧光的碳素利用酶试验。发明详述本发明的通用测定系统被设置成为具有预定数目反应小室或池的简便的卡板。将用这样一种结构形式来说明本发明的检测系统。这不意味着对本通用检测系统的限制，因为，还可以将它设置成为符合预定用途的很多种适合的形式。
本发明的检测系统能够鉴定样品中属于多个完全不同群微生物的任何一种微生物。在一个优选的实施方案中，该检测系统包括一套预定的非重复性生化试验，它们被配置在预定数目的反应小室内，其中每一个生化试验包括一个针对一种酶或一组酶的底物，进而如果其中的底物受这种酶或这组酶的作用，将导致在反应小室内形成可检测的产物；并且其中来自各试验组合的可检测性产物被用于鉴定样品中的微生物。
关于本发明的通用检测系统在此所用的名词“非重复性”，意指该预定的一套生化试验，如本领域所知，对于各族和/或群并不是基于族特异性或群特异性的配方。相反地，本发明的各生化试验是族和群无关的。优选的是，在一块卡板中对一种底物的使用不多于1次。但是，在某些情况下，可能需要对同一底物使用几次，不过是在例如不同的缓冲系统中。
如下发现是一次巨大进步，形成了本发明的检测系统和方法鉴定例如临床样品中的微生物不需要群特异性配方，此样品中可能含有来自多个完全不同群的任何一种微生物。
在此所指的形成可检测性产物，优选地包括在反应小室内形成荧光产物或生色产物，或者发生颜色或荧光改变。其它一些可检测性产物，例如通过放射性或发光改变进行检测的产物，也可用于本发明的实际测定中。
配置在本发明通用检测卡板上试验的数目，足以鉴定样品中属于多个完全不同群的任何一种微生物。例如，如果需要构成一种能够鉴定如下群中任何一种微生物的通用检测卡板肠道菌，非发酵菌，厌氧菌、和在合成培养基上不能生长的菌，适当的试验组合可容易地通过例如在实施例3中简述的如下程序来确定。这种试验选择程序是累接性的，即对一组试验进行选择，试运行，然后进行实测。如果这给试验不能通过实测。那么可对它进行修改，例如，可选择不同的底物浓度，也可增加或删除某个试验，等等，再次试运行和再次实测，依此类推。为了鉴定至种的水平而不是属的水平，一般需要较多的试验数目。对于某一特定用途的最少和/或最佳试验数目，可容易地根据本文的教导运用已知的统计学技术来确定。这种技术的一个实例可在下面实施例3中见到。
在优选的实施方案中，本发明的检测系统包括用于检测肽酶，糖苷酶，糖发酵酶，脲酶，脱羧酶，酯酶，碳素利用酶，磷酸酶，或色氨酸酶的至少一种试验。在其它优选实施方案中，此测定系统包括用于检测至少一种肽酶和至少一种糖苷酶的试验。
此测定系统还可以进一步包括用于检测至少一种糖发酵酶，至少一种脲酶，至少一种脱羧酶的试验，用于检测至少一种酯酶和至少一种碳素同化酶的试验，以及它们的各种组合形式。在本发明的其它优选测定系统中，该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定在如下菌的至少二种中的微生物肠道菌，非发酵菌，厌氧菌，酵母菌，葡萄球菌，链球菌，肠球菌，和合成培养基中不生长的菌。另一个优选的测定系统能够鉴定在如下菌的至少一种中的微生物葡萄球菌，链球菌，肠球菌，棒状杆菌，乳酸杆菌，片球菌；明串珠菌，差异球菌，漫游球菌，克吕沃尔氏菌，勒米诺氏菌，嗜血杆菌，奈瑟氏菌，摩拉氏菌，沙门氏菌，梭状芽孢杆菌和利斯特氏菌。
在本发明的另一个优选的测定系统中，该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定在厌氧菌，酵母菌或合成培养基内不生长菌中至少一种的微生物，属于厌氧菌和酵母菌或合成培养基内不生长菌的微生物，或者属于酵母菌和合成培养基内不生长菌的微生物。
在其它优选的实施方案中，本发明的测定系统能够鉴定属于葡萄球菌，链球菌，或肠球菌中至少一种和厌氧菌，酵母菌，肠道菌，非发酵菌或合成培养基内不能生长菌中至少一种，或者它们的组合中的微生物；属于葡萄球菌，链球菌，和肠球菌的微生物，属于酵母菌，厌氧菌，和合成培养基内不能生长菌的微生物；或者属于肠球菌，葡萄球菌，链球菌，厌氧菌，酵母菌和合成培养基内不能生长菌的微生物。
本发明通过应用一个检测系统，鉴定样品中可能存在的至少二个完全不同群微生物的方法包括如下步骤a)将样品加到含有底物的各反应小室中；b)如果存在酶，使其与该底物发生反应；c)通过检测某一试验中可检测的产物来确定样品中此种酶的存在，和d)将预定试验组合的结果同至少一个预定的标准比较，以便鉴定样品中的微生物。
本发明还提供了检测微生物碳源利用的试验，其中该试验包括至少一种碳源和至少一种荧光指示剂，微生物作用于碳源，引起pH改变，pH改变则导致指示剂的荧光改变，这种荧光改变指示该微生物对碳源的利用。
在一个特别优选的实施方案中，该通用的检测卡板能够将(ⅰ)肠杆菌科，葡萄球菌科，肠球菌科和链球菌科，以及(ⅱ)厌氧菌群，酵母菌群和合成培养基内不生长的菌群中的任何一种，鉴定到所需要的水平，例如属和/或种。
反应小室的容积一般是根据方便和经济-有效的原则进行选择。
用于制造这种卡板的适合材料应该是基本上与酶测定成分无反应性的，包括各种塑料如聚苯乙烯，PVC及其它。
在一个实施方案中，本发明的通用检测卡板可用于鉴定多群微生物中的任何一种微生物。微生物可被鉴定至独立的属和/或种，优选地是鉴定至种的水平。
本发明的通用检测卡板可被配置用于鉴定细菌和酵母菌，例如，完全不同群的细菌如肠道菌和非发酵菌；厌氧菌；葡萄球菌，链球菌和肠球菌；以及合成培养基内不生长的菌。
在一个实施方案中，该通用检测卡板包含带有不同生化试验的多个反应小池。但是，在另一个实施例中，该通用检测卡板包括至少一个特定的生化试验，其中该试验是在含有相同的底物，但含有不同缓冲液的不同反应池内进行，不同的缓冲液包括如TRIS、HEPES,MOPS,PIPES，组氨酸缓冲液，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液，或碳酸盐缓冲液。例如，本发明通用检测卡板的一个实施方案，包括在一个反应池内使同在Tris中的底物(即甘氨酰-甘氨酸7-AMC)，以及在另一个反应池内使用在Hepes中的底物的肽酶试验。
该通用检测卡板各反应池内的pH，一般是大约5-9。例如，肽酶和糖苷酶试验典型地是分别在大约pH7-9和pH7-8下进行，糖发酵酶试验在大约pH7-8下进行，而碳素利用酶试验典型地在大约pH5.0-6.0下进行。
在另一些情况下，该通用检测卡板包括至少一个在含有酶底物异构体的不同反应池内进行的生化试验。在此实施方案中，这种异构体可以是例如对映体，非对映体，或顺-反非对映体。另一方面，该底物还可以是异构体的混合物。例如，半乳糖的α-和β-异构体是用于糖发酵酶试验的适合异构体。参见上面表Ⅵ。
用于该通用检测卡板上的待测样品是从基本上是微生物纯分离物得到的微生物悬液。
这种基本纯的分离物可通过几种熟知的方法得到。例如，在一种方法中，是用能够支持所需微生物群生长的液体、固体或半固体培养基预培养样品。更具体地说，可将样品在选择性固体或半固体培养基上预培养，以便得到从其中可获得基本是微生物纯分离物的菌落。如果需要，此基本纯的分离物可被进一步选择，以便增加所需微生物的数量。在此二种情况下，该分离物都是悬浮于表面活性剂溶液中，以便形成适合用于该通用检测卡板的悬液。典型的情况是，这种悬液具有大约0.1-5McFarland单位的密度，优选地是大约0.5McFarland单位。在某些情况下，为了更快地以通用检测卡板得到结果，在此范围内较高的悬液密度是优选的。对微生物样品进行预培养的方法是熟知的。
在为本发明的通用检测系统选择测定法时，可选择一组测定，配置在适当的卡板上，并如下面所述进行测定，以便获得一个预定的标准(机率模型)，用于鉴定属于完全不同群微生物的任何一种微生物。
如上面所述，很多种荧光测定法(例如荧光发生测定，荧光检测)比色测定法和荧光猝灭测定法，可用于本发明的通用检测系统。
此外，多种底物都适合用于其中各种测定法。例如，在本发明的优选实施方案中，荧光发生和/或荧光检测测定法被选择用于此通用检测系统。在这些实施方案中，荧光发生测定法包括至少一种生荧光底物，优选地是如下一种生荧光底物，它被酶催化断开，形成可检测的荧光产物。在特别优选的实施方案中，生荧光底物典型地是由共轭结合于荧光团的底物组成。荧光检测测定包括至少一种底物，优选地是如下一种底物，它与样品中至少一种酶发生反应，导致可由荧光指示剂检测的pH改变。已经公开了很多种适合的荧光团和荧光指示剂。参见例如下面的表Ⅶ、以及Hangland.R.P.荧光探针和探测性化学制剂手册，第6版(1996),Molecular Probes,Inc；Bascomb.S.(1987)Methods in Microbiol,19,106,Mahafi,M.et al.(1991)Microbiological Rev.335。
用于本发明通用检测系统的示范性底物被列入下面的表Ⅵ中。底物1-25是用于肽酶试验的生荧光底物。底物26-34是用于糖苷酶试验的生荧光底物。底物35，和37-54是使用4-甲基伞形酮荧光测定指示剂进行糖发酵试验的底物。底物55-60是碳模拟底物。底物61-62,64-65,73-78,88-89，和92是用于糖发酵试验的底物。底物63是用于脲酶试验的底物。底物66-70,79-80和90-91是用于糖苷酶试验的底物。底物71,81-83，和93-95是用于肽酶试验的底物。底物72和84是用于磷酸酶试验的底物。底物85-87是用于脱羧酶试验的底物。底物96是用于吲哚试验的底物。
表Ⅵ
表Ⅵ(续)
用于本发明实际应用中肽酶试验的示范性生荧光底物包括，氨基酸，肽，或共轭结合于荧光团的多肽。适合荧光团的例子显示在下面表Ⅵ中，并特别包括β-萘胺和7-氨甲基香豆素(7-AMC)。用于脂酶试验特别优选的荧光团是7-AMC。制备和使用生荧光底物的方法对本领域是已知的(参见例如英国专利1,547,747和欧洲专利0,000,063)。
表Ⅶ
适合用于肽酶试验的肽和多肽是长度大约2-20个氨基酸的肽，以单链，分支链或环状排列。适合的氨基酸包括20种常见的氨基酸丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，和酪氨酸。其它适合的氨基酸包括稀有的或非蛋白质氨基酸，如那些在纤维状蛋白和某些真菌及植物毒素中发现的氨基酸，如4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，ε-N-甲基赖氨酸，3-甲基组氨酸，锁链赖氨素，异锁链赖氨素，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，刀豆氨酸，黎豆氨酸，和β-氰丙氨酸。这些氨基酸胺需要时可以是D或L构型。用于肽酶试验的示例性底物被列举在上面的表Ⅵ中。
在另一个优选的实施方案中，本发明的通用检测卡板包括至少一个优选地以荧光发生方式进行的糖苷酶试验。在此实施方案中，该糖苷酶试验包括至少一种生荧光底物，优选地是如下一种生荧光底物，它在样品中存在糖苷酶时被断开。适合用于此糖苷酶试验的生荧光底物包括碳水化合物，一般是糖，与适当荧光团的共轭结合物。适当荧光团的例子在上面的表Ⅶ中已有描述。特别优选的荧光团是4-MeU。适合用于此糖苷酶试验的糖包含大约3-8个碳原子(例如四糖，戊糖，己糖或庚糖)，以及含有大约2-10个共价连接的糖单位，分子量约350-4000道尔顿的糖和二糖。用于此糖苷酶试验的例证性生荧光底物列举在上面的表Ⅵ中。
在另一个实施方案中，本发明的通用检测卡板包括至少一个以荧光检测方式进行的糖发酵酶试验。在此实施方案中，该糖发酵试验包括至少一种如那些在上述糖苷酶试验中所述的糖或糖类；以及至少一种荧光测定指示剂。适合的荧光测定底物的例子显示在上面表Ⅶ中，还包括4-MeU。优选地是，该荧光测定指示剂能够在大约6-8的pH范围内发荧光。特别优选的荧光测定指示剂是4-MeU。用于此试验的辅助底物包括多糖如具有分子量约104-106的淀粉和糖原。用于此糖发酵酶试验的例证性底物列举在上面的表Ⅵ中。
在另一个实施方案中，该通用检测卡板包括至少一个以荧光检测方式进行的碳素利用试验。在此实施方案中，该碳素利用试验包括至少一种碳源，优选地是一种碳源以及至少一种适合的荧光测定指示剂，优选地是一种荧光测定指示剂。适用的荧光测定指示剂列举在上面的表Ⅶ中，并包括4-MeU及其它一些化合物。特别优选的荧光测定指示剂是β-甲基七叶亭，能够在大约5-7的pH范围内发荧光。
适合用于该碳素利用试验的碳源包括，烯烃，炔烃，醇，醚，酯，腈，硫化物，砜，硫醇，酮，亚砜，醛，酰胺，胺，羧酸，或苯甲酸。这种碳源一般含有大约2-10个碳原子，以直链，分支链或环状的方式排列，分子量大约为40-500。优选的碳源是能在水溶液(例如生理盐水和包括Tris或Hepes的缓冲液)中混溶的，并且是不挥发性的。上面表Ⅵ提供了适合碳源的例子。
在本发明的一个优选实施方案中，该检测系统的底物包括，赖氨酸(AMC)，亮氨酸(AMC)，甲硫氨酸(AMC)，甘氨酰-脯氨酸(AMC)，异亮氨酸(AMC)，海藻糖，麦芽糖，L-色氨酸(7-AMC),4-MeU-磷酸盐，β-D-木糖苷-4MeU，羟基-脯氨基-AMC,β-D-葡糖苷酸-4MeU，酪氨酸(AMC),4-MeU-β-D-半乳糖苷，甘露糖，蔗糖，和脯氨酸(AMC)。在另一个优选的实施方案中，其底物还进一步包括果糖，甘油，L-组氨酸7-AMC，焦谷氨酸(AMC)和4-MeU-β-D-糖苷。在再一个优选的实施方案中，其底物还包括L-丝氨酸7-AMC，纤维二糖，精氨酸(AMC)，和4-MeU-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷。
上述荧光检测试验形成可借助于常规的非破坏性荧光仪测定法或荧光镜法检测的产物，因而可以对试验中的荧光产物进行定量。例如，特别优选的自动化荧光仪是MicroScan Walkaway系统，可从DadeMicroScan Inc.购得。但是，本发明的通用检测系统还可以采用其它可购得的仪器。
在本发明的一个实施方案中，该通用检测卡板包括至少一种以比色(生色)方式进行的试验。例如，在此公开的肽酶试验，糖苷酶试验，糖发酵酶试验或碳素利用酶试验，可以按比色(生色)方式进行。已知多种比色测定法可用于检测肽酶如焦谷氨酰基氨基肽酶；L-丙氨酸氨基肽酶，芳基肽酶，芳基酰胺酶，和糖苷酶如β-D-葡糖苷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖水解酶，α-D-半乳糖苷酶，β-D-葡糖苷酶，神经氨酸苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶和N-乙酰基-(3-D-氨基葡糖苷酶，N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶，α-D-阿拉伯糖苷酶，β-D-岩藻糖苷酶和β-D-木糖苷酶。进而，用于检测糖发酵酶的比色测定法也是周知的，并且可被用于本发明的检测系统，适合用于本通用检测卡板的辅助比色测定法包括已知用于检测如下酶的试验，例如脲酶，氧化酶，还原酶，水解酶，氢化酶，酯酶，磷酸酶，色氨酸酶，蛋白酶如胰凝乳蛋白酶，脱羧酶如鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶，以及能够同化柠檬酸循环中间产物的酶。如上所述，这些测定法可被用于本发明的通用检测系统，并且可用机率分析法进行测定。
适合用于本方法的比色试验可以按各种检测方式来进行。例如，在某些情况下，含有生色团的底物以直接检测的方式被使用。在这种情况下，生色底物可以包括例如，邻-硝基酚，间-硝基酚或对-硝基酚的酯，吲哚酚或5-溴-4-氯-3-吲哚酚的酯或对硝基苯胺的芳基肽衍生物。在比色测定中直接检测生色团的释放。但是，在另一些情况下，要求借助于适当的试剂，以间接检测的方式进行比色测定。这种测定法的例子包括无机的酶反应产物(例如硝酸盐)与无机酸如对氨基苯磺酸和α-萘胺的化学反应。在另一种情况下，要求用pH反应性指示剂分子检测此试验中pH改变的间接方式进行比色测定。这类分子的例子包括溴百里酚兰和酚红。其它一些适合的比色测定例如肽酶生色试验，用对-二甲基氨基肉桂醛检测从包括β-萘酰胺的生色底物中β-萘胺的释放。在再一种情况下，适合的比色测定可以包括对-硝基苯胺衍生物与重氮化合物的反应，用于提高检测灵敏度。
特别是，公开了几种比色测定法，用于检测和鉴定酵母菌和类酵母菌微生物如Protheca以及奈瑟氏菌属，嗜血杆菌，粘膜炎布兰汉氏菌，和阴道加德纳尔氏菌。
下面的表Ⅷ提供了适用于比色测定的生色团的例子。
表Ⅷ
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因此，在本发明的一个优选实施方案中，其通用检测卡板包括这样一些生化试验；其中这些试验又进一步包括至少一种用于检测肽酶，糖苷酶，糖发酵和碳素利用试验的测定，优选地是以荧光方式测定；并且还包括至少一种用于检测脲酶，脱羧酶(优选地是鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶)，酯酶和色氨酸酶的比色测定法。这些测定法还可以以各种方式组合，这取决于对该检测系统所计划的用途。
本发明的一个优选的检测系统包括用于检测至少一种肽酶和至少一种糖苷酶的试验。另一个优选的检测系统进一步包括用于检测至少一种糖发酵酶的试验。再一个优选的检测系统另外还包括用于检测脲酶，脱羧酶，酯酶或碳素利用酶，或者其组合的至少一种测定法。
在本发明的另一个实施方案中，其通用检测卡板包括这样一些生化试验，其中这些试验包括至少一种用于检测如下酶的测定过氧化氢酶，脱羧酶如谷氨酸或精氨酸脱羧酶，氨基酸脱酰胺酶如精氨酸脱酰胺酶，脂肪酶，焦磷酸-二酯酶，DNA酶，氧化酶，芳基硫酸酯酶，或3-羟基丁酮/联乙酰生成酶。在此实施方案中，按需要以比色方式或荧光检测方式进行测定。
在此所用的名词“预定的”用以表示根据已知的统计学技术如DFA或线性回归技术，某生化测定法已被选择。在实施例3中提供了一个优选的统计学技术实例。因此，在此使用的“一套预定的生化测定或预定的生化测定组合”，是已通过用适当的统计学技术选择的一组生化测定。
下面的非限制性实施例是对本发明的说明。
实施例1-通用检测系统用于本发明的底物可用各种方式配制。一般是设计将底物配方用于方便的缓中液中，例如pH范围在5-9的TRIS或HEPES缓冲液。选择底物和缓冲系统的特定量或浓度，使特定生化测定的Vmax最佳化。
更具体地说，肽酶试验底物被选择使其具有大约0.01-1.0mM的最终浓度。在适当的缓冲剂如Tris中(例如Tris磷酸盐)，浓度为大约0.1-1.0M。对于肽酶试验，优选的pH范围是约7.5-8.5。将底物按需要溶解于允许的溶液中，如水，缓冲液，或二甲基亚砜(DMSO)。可以类似的方式设计糖苷酶试验的底物配方，不同的是该底物的浓度一般是0.1-3.0mM,pH约为7-8。对于碳素利用试验和脱羧酶试验，在脱羧酶缓冲液内进行此试验是优选的，虽然如果需要也可以使用其它缓冲液如Tris或Hepes缓冲液。脱羧酶缓冲液是通过组合如下成分来配制酵母浸出物(约0.1-1.0％(w/v))，蛋白胨(约0.1-1.0％(w/v)),吡哆醛-5-PO4(约0.01-0.1mM),10％(w/v)甘油储存液(约0.5-2％(w/v)),0.02M 4-β-甲基七叶亭(约0.1-1mM),Phallic酸(约1.0-10.0mM),pH5-6，氨基酸或碳源约占0.5-5％(w/v)。
糖(产酸)试验典型地是在Hepes缓冲液或其它适合的缓冲液(约0.5-2.5mM)中进行，pH在约7-8。该试验的其它成分包括4-MeU(约0.01-0.25mM)，蛋白胨(约0.01-0.5％(w/v))，糖(约0.05-2％(w/v))，在大约1升去离子蒸馏水中。
表Ⅵ列出了用于本通用检测系统的示范性底物。下面的部分(A-D)将描述本发明特别优选的底物的配制。
在一个实施方案中，底物是配置在检测卡板中，如带有小池(反应小室)的微量滴定板，小池以例如线状排列。每个反应小室约0.3ml。
每种底物用于一个以荧光或比色方式进行的生化测定。按照标准的统计学技术将每个试验的结果编码，并与数据库进行比较，以便以标准的微生物学培养技术鉴别多群微生物。所使用的数据库通常是机率模型，它被构形成为例如含有将在样品中被鉴定的所有微生物族或群成员的单一数据库。另一种方式(或者此外还有)是，该数据库是，被构形成为对样品中特定微生物族群特异的一系列亚数据库的机率模型。用熟知的统计学方法构建于用于本发明的数据库(参见例如下面的实施例3)。
一般情况下，用于分配到通用检测卡板小池中的底物制剂，是按适当的最后体积配置在检测卡板的每个小池中，此后，在室温下使小池中的溶液干燥。通过将试验配方的各成分稀释或浓缩，可使分配液的体积按比例减少或增加。在绝大多数情况下，底物制剂是以过滤除菌，分配之前贮于冰箱内。
A-生荧光肽酶试验制备肽酶Tris缓冲液(pH8.0)。此缓冲液被调至pH7-9。
对于上述表Ⅱ中的底物1-13，在二甲基亚砜(DMSO)中将下面的底物溶液配制成大约0.1-0.3mM的溶液底物是从Sigma或Biosynth购得。将约5ml每种溶液置于分配管内。用肽酶Tris缓冲液将此溶液稀释至500ml。对于底物95，是通过在5ml DMSO中混合约0.01-0.02g酪氨酸(AMC)来配制TYR浓缩物。对于底物83，是将大约8-10mg脯氨酸(AMC)加到大约5ml DMSO中。将每个分配管加塞，并倒转几次，然后进行震荡。
上面表Ⅵ中底物14-25的配制基本上同底物1-13，不同的是这些底物是以肽酶Hepes缓冲液(pH8.0)稀释。在缓冲剂成分溶解之后，溶液被校准至pH约7-9。
B-生荧光糖苷酶试验上面表Ⅵ中的底物26-34是在DMSO中配制成约0.9mM-1.gmM的溶液；这些底物中的每一个都是从Sigma购得。
将5ml每种底物溶液加入到分配管内，并随之加入10ml糖苷酶缓冲液(见下面)。通过将Trizma碱和一代磷酸钾加到去离子水中配制糖苷酶磷酸钾缓冲液。将此溶液混匀后，校准至pH约7-7.8。用此缓冲液将约5ml浓缩物稀释至约500ml。
对于底物70，是通过在大约5ml DMSO内加入约0.3-0.5g MeU-β-D-半乳糖苷来配制BGAL浓缩物。再取2-3ml这种溶液，以糖苷酶缓冲液稀释至最终体积约500ml。对于底物76和77，是通过在约1升水中加入约3-5g甘露糖或蔗糖来配制糖储备液。
C-荧光测定的糖发酵酶试验对于上面表Ⅵ中的底物35，是通过在约40ml去离子水中混合约1-2g对苯二酚葡糖苷(Sigma)来配制2x对苯二酚葡糖苷储备液(ARB储备液)。再取约20ml ARB储备液置于分配管内，加入约12.5ml糖缓冲液和2ml 4-MeU储备液。用高压灭菌的去离子水将此溶液稀释至最终体积约500ml。糖缓冲液是通过在1升去离子水中混合一代磷酸钾，二代磷酸钾和蛋白胨水来配制。将这些成分混匀后，再调pH至约7-8。蛋白胨水溶液是通过在约10ml去离子水中混入lg蛋白胨来制备。MeU储备液是通过在20ml去离子水中混入约0.1g Na+甲基-伞形酮-4来配制。底物36是AMC对照。
对于上面表Ⅵ中的底物37-54，其2x糖储备液是通过在约40ml去离子蒸馏水中分别混入约1-2g下面的糖类来配制半乳糖醇，赤藓糖醇，果糖，半乳糖，甘油，菊糖，乳糖，麦芽糖，松三糖，鼠李糖，核糖，海藻糖，松二糖，木糖或腭糖(palatinose)。其中每种糖都是从Sigma购得。
上面表Ⅵ中的底物37，是通过在约400ml去离子水和约2ml 5NNaOH中混入约1-2g半乳糖二酸来配制。对于底物50,2x淀粉(STA)储备液是通过在约445ml水中，将约0.5-1g淀粉(Baker)与Pluronic P-104(10％溶液)混合而配制的。
上面表Ⅵ中除47和50以外的其余底物，是将每种2x糖储备液约20ml加入到分配管中，随后加入约12.5ml糖基础储备液，再加入2ml MeU储备液，并以去离子蒸馏水稀释至约500ml。对于底物47，是将约400mlMUC储备液加到分配管中，随后加入约12.5ml糖缓冲液储备液和2mlMeU储备液。再将此溶液用高压灭菌的去离子蒸馏水稀释至约500ml。对于底物50，是将约452.5ml STA储备液加到分配管中，随后加入约12.5ml糖缓冲液和约2ml MeU储备液，再用高压灭菌的去离子蒸馏水将此溶液稀释至约500ml。
D-荧光测定的碳素利用试验上面表Ⅵ中的底物55-60是通过形成一个适当的碳源储备液来配制。每种储备液是通过在约600ml脱羧酶基础缓冲液中加入约12g如下的碳源来配制乙酰胺，苯甲酸，甲酸，马来酸，丙酮酸，和丙二酸。各种碳源均购自Sigma。脱羧酶试验基础液是通过制备一个储备液来配制。此储备液是在约2700ml去离子水中，混合了约9-10g酵母浸出物，约70ml β-甲基七叶亭的2x储备液，约10-20g蛋白酶蛋白胨-3，约300ml 10％甘油，和约2-4g苯二甲酸(钾盐)。2x β-甲基七叶亭储备液是通过在约400ml 2-甲氧基乙醇和约600ml去离子水中混合约3-4g 4-甲基七叶亭来配制。使这些成分溶解后，校准至pH5-6。对于底物55-60，是将500ml这种适当的溶液加到分配管中进行分配。
E-补充试验已报导了很多种生化试验(参见例如，Bascomb,S.同上，和Manafi,et,al，同上)。可借助于在此所述的方法选择适合用于本发明的试验。参见实施例3。在优选的实施方案中，补充试验包括如下几种ⅰ)脲酶试验-已报导了多种用于检测脲酶的方法，包括测定pH改变和NH3的产生。参见例如Godsey et al(1981)J.Clin.Microbiol.13,483，和Bascomb.S.同上。
ⅱ)色氨酸酶试验(吲哚试验)-已报导了几种检测色氨酸酶的方法，包括比色测定法和基于荧光猝灭的测定法。例如，先前已描述了一个优选的色氨酸酶试验。参见Morris et al，美国专利5,173,434，在此全部引入作为参考。也见Bascomb.S.同上。
ⅲ)酯酶和脱羧酶试验-酯酶试验可按几种方式进行，包括荧光测定法(参见例如，Manafi et al同上)。对用于脱羧酶检测的多种试验已有描述(参见例如，Bascomb,S.同上)。在一个优选的实施方案中，鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试验是通过检测碱性胺的形成，它引起pH增加，可通过荧光pH指示剂4-甲基七叶亭来检测。在另一个实施方案中，是以熟知的比色测定方式进行脱羧酶试验(参见例如，MacFaddin,J.F.(1980)用于鉴定医学细菌的生化试验，第二版，Williams and Wilkins,Baltimore and London)。
使用中，用大约104-108CFU/ml的待测样品对通用检测卡板接种，然后置于Walkaway(W/A)仪中，35℃温育。用WADEV探测软件收集样品的数据，在40分钟(基线时间),120分钟和140分钟进行读数。用RENOK水化器/接种器对卡板上各小池接种之后，将接种物密度调整至0.08±0.01 Artel读数。用统计学技术，使各种酶试验结果通过ID模型处理，以便对样品中的微生物进行检测和鉴定。优选的统计学技术是Bayesian机率分析法。在下面的实施例中，对样品的检测和鉴定是基于用选定种类的酵母菌和细菌的纯培养物预先构成的数据库。
F-质量控制对通用检测卡板每周进行一次质量控制试验，在某些情况下是每天进行一次。用于数据库分离物的所有传代平板，对其纯度都要严格检查，任何受污染的平板必需重新培养。在试验过程中，应采取各种措施确保数据库的质量，以致于对原始数据须作严格检查，对任何可疑的结果，例如缺乏清楚的荧光，未加入试剂，特定菌株的反应速度明显不同于所有其它相同的种类，都必须重复试验，或者得到确证之后才能用于数据库。
可用各种适当的质控分离物对通用检测卡板进行测定，包括那些用于MicroScan RNID2,RPID,HNID，以及快速厌氧菌和酵母菌检测卡板的微生物。下面表Ⅸ列举了适用于本通用检测卡板的质控微生物的例子。适合质控微生物的补充例子包括产酸克雷伯氏菌，鲍氏不动杆菌，腐败希瓦氏菌，大肠杆菌，嗜水气单孢菌，普通变形杆菌，荧光假单胞菌，铜绿假单胞菌。通常在此通用检测卡板上还包括生理盐水对照，用于确立评定检测结果的基线。
表Ⅸ
实施例2-数据库的构建各种微生物如酵母菌和细菌都可被用于构建适合用于本通用检测卡板的数据库。例如，下面各群微生物被用于构建适合的数据库HIND菌群阴道加德纳尔氏菌，溶血嗜血杆菌，流感嗜血杆菌Ⅰ群，流感嗜血杆菌Ⅱ群，流感嗜血杆菌Ⅲ群，流感嗜血杆菌Ⅳ群，流感嗜血杆菌Ⅴ群，流感嗜血杆菌Ⅵ群，流感嗜血杆菌Ⅶ群，副流感嗜血杆菌Ⅰ群，副流感嗜血杆菌Ⅱ群，副流感嗜血杆菌Ⅲ群，副流感嗜血杆菌Ⅳ群，副/嗜沫嗜血杆菌，惰性嗜血杆菌，粘膜炎布兰汉氏菌，灰质奈瑟氏菌，金黄奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，解乳糖奈瑟氏菌，脑膜炎奈瑟氏菌，粘膜奈瑟氏菌，奈瑟氏菌，干燥奈瑟氏菌。
酵母菌群头状芽裂殖菌，白色念珠菌，链状念珠菌，季也蒙念珠菌，土生念珠菌，克柔氏念珠菌，郎比可念珠菌，解脂念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，伪热带念珠菌，皱褶念珠菌，类星形念珠菌，热带念珠菌，热带念珠菌(sn)，桶形念珠菌，浅白隐球菌，罗伦特隐球菌，新型隐球菌，指甲隐球菌，异常汉逊酵母，多形汉逊酵母Protothecawickerhamii，胶粘红酵母，深红酵母，酿酒酵母，念珠球拟酵母、光滑球拟酵母，平常球拟酵母，白色丝孢子菌。
革兰氏阳性菌群产单核细胞李斯特氏菌，克氏微球菌、滕黄微球菌，里拉微球菌，玫瑰色微球菌，栖息微球菌，变异微球菌，片球菌，阿尔莱特葡萄球菌，耳葡萄球菌，头状葡萄球菌，山羊葡萄球菌，肉葡萄球菌，溶酪葡萄球菌，产色葡萄球菌，孔氏葡萄球菌，表皮葡萄球菌，马胃葡萄球菌，母鸡葡萄球菌，溶血葡萄球菌，玉米粥葡萄球菌，家畜葡萄球菌/产色亚种，家畜葡萄球菌猪亚种，中间型葡萄球菌，克氏葡萄球菌，缓慢葡萄球菌，路邓葡萄球菌，腐生葡萄球菌，施氏葡萄球菌，赛氏葡萄球菌，模仿葡萄球菌，华纳氏葡萄球菌，木糖葡萄球菌，G.morbillorum，无乳链球菌B群，咽炎链球菌群，牛链球菌，马肠链球菌，似马链球菌，缓症链球菌群，变异链球菌，肺炎链球菌，化脓链球菌，唾液链球菌，血液链球菌Ⅰ，兽疫链球菌，铅黄肠球菌，鸟肠球菌，粪肠球菌，类粪肠球菌，鹑鸡肠球菌，海氏肠球菌，蒙氏肠球菌，棉子糖肠球菌，孤立肠球菌，和厌氧菌群吉氏拟杆菌，厌氧性消化链球菌，胞弱拟杆菌，卵园拟杆菌，单形拟杆菌，解脲拟杆菌，普通拟杆菌，内脏拟杆菌，齿双歧杆菌，死亡梭杆菌，坏死梭杆菌，具核梭杆菌，变形梭杆菌，不解糖卟啉单胞菌，二路普雷沃氏菌，颊普雷沃氏菌，人体普雷沃氏菌，产黑素普雷沃氏菌，无害梭菌，产气荚膜梭菌，索氏梭菌，产芽胞梭菌，迟缓真杆菌，淤泥真杆菌，痤疮丙酸杆菌，巨大消化球菌，小韦荣氏球菌，不解糖消化球菌。
此特定数据库的分类细目包括如下厌氧菌(54种)，在合成培养基下易生长菌(21种)，肠球菌(10种)，葡萄球菌(28种)，链球菌(14种)，酵母菌(42种)。
为了用上述各种酵母菌和细菌构建数据库，对每种约30个分离物(共约338个分离物)，用一套生化试验进行测定，这些生化试验已用熟知的统计学技术如在实施例3中公开的技术进行了鉴定。然后将这些测定结果编排成数据库(机率模型)，这种数据库由含有待鉴定的所有微生物族成员的单一数据库，或者对每一族微生物特异的亚数据库系列组成。
实施例3-为通用检测卡板选择试验组合的示范性方法表Ⅵ中96个非重复性底物如下面所述被用于构成机率模型。
下面将对用于单一微生物群如革兰氏阴性菌群酶试验的选择进行描述，以便对此过程给予说明。对发酵菌，非发酵菌，和以普通临床种类为代表的其它菌群，可采用同样的程序。
A)细菌分离物及其制备用常规的IDS对来自MicroScan储备培养物的细菌进行测定。
试验之前，对储备菌株传代2次，以便确保其纯度和活力。绝大多数试验分离物是在生长选择性琼脂板(例如对革兰氏阴性菌特异的MacConkey琼脂)上培养，35℃培育约18-24小时。在一种生长选择性琼脂上不能生长的分离物可在另一种琼脂上生长(例如，在添加了5％羊血的胰胨豆胨琼脂板上，在非CO2培养箱内，35℃对革兰氏阴性菌培养18-24小时)。
分别在加有6.5ml 0.4％生理盐水的试管内制备细菌悬液，用MicroScen浊度计，使之具有相当于0.5 McFarland标准单位的Pluronic。将含有相同分离物的4支试管汇集装入一个Renok盘内，用MicroScan Renok水化接种器进行接种。在将接种物分配进入卡板之后，对选定的试验加入3滴矿物油。然后将卡板放入Walkway系统中35℃温育，从开始接种起温育30分钟。
b)数据收集和分析用二个MicroScan-WalkAway分类系统，四个WalkAway96系统，和一个WalkAway40，对所有4个试验的这些卡板进行温育和读数。用MicroSean研究数据搜索软件收集数据，此软件比在WalkAway见到的数据处理系统(DMS)软件能收集更多的数据点，即0分钟，40分钟，120分钟和140分钟。用MicroScan校准卡板对每台仪器每周校准2-3次。然后，将在探索软件中作为模拟荧光单位(AFU′S)收集的原始数据以ASCI文件格式转化成使用常规软盘的统计学分析软件(SAS)。
按照标准的Bayesian机率分析法，用前述的生化试验构成了精确、完整和可靠的数据库。
c)机率模型的构建，如果酶试验组合以正常化机率≥85％(优选地是90％或95％)正确地鉴定到种(或组合种)的水平并且这种鉴定与参照鉴定一致，则鉴定是符合的。这被认为是“种符合，高机率”。如果在种(或组合种)水平的鉴定没有得到≥85％的机率，但是其正确的种显示是低机率的一种可能的鉴定(2-5分类单位)，则认为是“种符合，低机率”，并需要用补充试验确证种的鉴定。在这种情况下，将进行补充的酶试验，用于更充分地区分待测的菌种。
“不正确的鉴定”表示不符合这些标准，如果试验组合61到96显示与最可能的分类单位预期的结果有过度的偏离，则得到“非常罕见的生物型”。如果酶试验不能以≥85％的机率给出种水平的鉴定，但是对于相同属/群成员的机率总和＞85％，则得到“属群鉴定，高机率”。
对所有的数据用SAS软件进行处理和分析。对于除吲哚试验和脱羧酶试验之外的所有试验，用如下等式将在数据库测定过程中收集的原始数据转化成比值比值=(最后荧光值-起始荧光值)/时间×100对于脱羧酶试验，可以用此相同的等式计算起始比值。但是，为了计算对鸟氨酸或赖氨酸的最后比值，对于脱羧酶的基础比率将被扣除。对于吲哚试验，在2小时对吲哚试验小池和荧光对照小池加入二甲基肉桂醛(DMCA)，并在2小时20分读数。用如下等式对此试验计算比值吲哚比值=荧光对照小池荧光值-吲哚试验小池荧光值。
检查所有原始数据和反应比值数据的错误，即重复输入，打印错误，或暗示微生物学污染的反常结果，发现错误时，输入数据库之前须进行重复测定或确证试验。
然后对数据库内的每个分离物求其单个反应比值。将这些定量比值数据转化成为定性数据，以便减少分离物之间和分离物内变异性的影响。一般情况下，对于特定试验的反应比值分布是双模态的，或者三模态的，即某些分类单位没有或仅有低反应比值，而其它一些分类单位有中等的或高反应比值。使用几种统计学技术和SAS编程语言，对各个试验计算其反应比值，并赋予数字比值(断点数值)，以便区分阳性和阴性结果。对于每个试验，在不同断点值的“分离数字”(Gyllenberg,1963,Rypka et al,1967,Lapage & Bascomb,1968,La Page et al,1970)，当被认为是全部或部分数据库分类单位的比值时，以及当以生理盐水接种的卡板观察到此比值时，它们被考虑选作断点值。对于二模态试验结果，如果分离物的反应比值大于此值，则此试验被记为阳性(+)，或者如果反应值小于此值，则此试验被记为阴性(-)。
对每个试验计算断点值之后，将来自革兰氏阴性菌各试验组合的结果从定量值转化成定性的阳性或阴性值。然后用不同的试验组合，构建不同的机率模型组(Bascomb et al.,1973)。用Bayesian机率鉴定模型(Wilicox et al,1973)对不同组机率模型进行评价，评定它们正确鉴定所有被测定分离物的能力，以及每个机率模型中的单个试验对其分辨能力，即区分种的能力有何贡献。进而，还评价这些试验是否容易操作，储存期限，容忍卡板配置变化的能力和对表层油的清除。应用所有这些标准，选出了满足上述符合记分的36个试验(见例如表Ⅵ中的61-96)接下来是评定这些组合试验的准确度。总的说来，应用85％正常化截止机率作为对鉴定的认可(“高机率鉴定”)，该系统在2小时20分钟内具有98.8％的综合准确度(93.9％准确到种，1.2％准确到属，3.6％准确到种，但需要补充试验)。采用90％正常化截止机率，而不是85％检验这些相同的数据，导致较小数目的分离物被鉴定到种的水平(30个分离物-0.9％)，并伴有需要补充试验，被正确地鉴定到种水平的分离物数目增加(33个分离物-1.1％)，但是，没有显著地减少不正确鉴定的数目(4个分离物-0.1％)。由于这个原因，选择了85％正常化似然性作为对鉴定认可的截止值。
对于具有临床重要性的分离物(包括24个常见的种)，组合酶试验61-96具有99.4％的综合准确度(97.5％准确到种，不需要补充试验，1.0％准确到属和0.9％准确到种需要补充试验)。
并且，以这些试验组合对所有革兰氏阴性发酵菌种测定的数据库结果，显示了98.8％的综合准确度(96.5％准确到种，不需要补充试验，1.1％准确到属，和1.2％准确到种需要补充试验)。总的来说，该系统具有98.1％的综合准确度(86.5％准确到种，1.4％准确到属的水平，和10.2％准确到种需要补充试验)这些试验组合在2小时20分钟内可鉴定119个分类单位(85个发酵菌种，和34个非发酵菌种)，包括24个有临床重要性的菌种。此外，全部有临床重要性分类单位的仅0.9％(通常在临床实验室遇到的100个分离物中少于1个)和数据库中所有分离物的3.7％，需要补充试验才能得到最后正确的鉴定。
在上面的详细说明中，已对本发明的原理，优选的实施方案和操作方法作了描述。但是，不能把打算在此寻求保护的本发明看作仅限于所公开的特定形式，因为这些公开内容被看作是说明性的而不是限制性的。本领域的技术人员依赖于本发明的精髓可能作出一些变化和改变形式。
权利要求
1．一种用于鉴定样品中微生物的检测系统，其中该测定系统能够鉴定可能存在于此样品中的至少二群完全不同微生物中的微生物，该检测系统包括预定组合的一组非重复性生化试验，它们被配置在预定数目的反应小室内，其中每个生化试验包括针对一个酶或一组酶的底物，进而如果这种酶或这组酶作用于该底物，将导致在反应小室内形成可检测的产物，并且，其中来自该生化试验组合的可检测性产物可用于鉴定样品中的微生物。
2．权利要求1的检测系统，其中对微生物的鉴定包括将微生物分类到属或种，或者此二者。
3．权利要求1的检测系统，其中该预定组合的非重复性试验，包括荧光测定法，比色测定法，或者二者的组合。
4．权利要求3的检测系统，其中的荧光测定法是以荧光发生方式或荧光测定方式进行。
5．权利要求3的检测系统，其中预定组合的非重复性试验在约15分到8小时内完成。
6．权利要求1的检测系统，其中预定组合的非重复性试验在约25℃-37℃的温度下进行。
7．权利要求6的检测系统，其中的比色测定法是可视性读数或用比色计读数。
8．权利要求4的检测系统，其中的荧光测定法是用荧光计读数。
9．权利要求1的检测系统，包括至少一种用于检测如下酶的试验肽酶、糖苷酶、糖发酵酶、脲酶、脱羧酶、酯酶，碳素利用酶，磷酸酶，或色氨酸酶。
10．权利要求9的检测系统，包括用于至少一种肽酶和至少一种糖苷酶的试验。
11．权利要求10的检测系统，另外还包括用于至少一种糖发酵酶的试验。
12．权利要求11的检测系统，另外还包括用于至少一种脲酶的试验。
13．权利要求12的检测系统，另外还包括用于至少一种脱羧酶的试验。
14．权利要求13的检测系统，另外还包括用于至少一种酯酶的试验。
15．权利要求14的检测系统，另外还包括用于至少一种碳素同化酶的试验。
16．权利要求1的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定在如下菌的至少二种中的微生物肠道菌和非发酵菌；厌氧菌；酵母菌；葡萄球菌，链球菌，或肠球菌；以及合成培养基中不生长的菌。
17．权利要求1的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定在如下菌的至少一种中的微生物葡萄球菌，链球菌，和肠球菌；棒状杆菌；乳酸杆菌；片球菌；明串珠菌；差异球菌；漫游球菌；克吕沃尔氏菌；勒米诺氏菌；嗜血杆菌和奈瑟氏菌；摩拉氏菌；沙门氏菌；梭状芽孢杆菌；和利斯特氏菌。
18．权利要求1的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定属于厌氧菌，酵母菌或合成培养基中不生长菌中至少一种的微生物。
19．权利要求18的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定属于厌氧菌和酵母菌或合成培养基中不生长菌的微生物。
20．权利要求19的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定属于酵母菌和合成培养基不生长菌的微生物。
21．权利要求1的检测系统，其中该预定组合的非重复性生化试验，能够鉴定属于葡萄球菌、链球菌、或肠球菌中至少一种和厌氧菌，酵母菌，肠道菌和非发酵菌或合成培养基内不生长菌中至少一种，或者它们的组合的微生物。
22．权利要求1的检测系统，其中该检测系统能够鉴定属于酵母菌，厌氧菌和合成培养基内不生长菌的微生物。
23．权利要求1的检测系统，其中该检测系统能够鉴定肠球菌，葡萄球菌，或链球菌；厌氧菌；酵母菌；和合成培养基内不生长的菌。
24．权利要求1的检测系统，其中的底物包括赖氨酸(AMC)，亮氨酸(AMC)，甲硫氨酸(AMC)、甘氨酰-脯氨酸(AMC)、异亮氨酸(AMC)，海藻糖，麦芽糖，L-色氨酸(7-AMC),4-MeU-磷酸盐，β-D-木糖苷-4MeU，羟基脯氨酸-AMC,β-D-葡糖苷酸-4MeU，酪氨酸(AMC),4-MeU-β-D-半乳糖苷，甘露糖，蔗糖，和脯氨酸(AMC)。
25．权利要求25的检测系统，其中的底物另外还包括果糖，甘油，L-组氨酸7-AMC，焦谷氨酸(AMC)和4-MeU-β-D-葡糖苷。
26．权利要求26的检测系统，其中的底物另外还包括L-丝氨酸7-AMC，纤维二糖，精氨酸(AMC)，和4-MeU-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷。
27．一种通过应用权利要求1的检测系统，鉴定样品中可能存在的至少二群完全不同微生物的方法，该方法包括a)将样品加到含有底物的各反应小室内，b)如果存在酶，使其与该底物发生反应，c)通过检测某一试验中的可检测产物来确定样品中这种酶的存在，d)将预定试验组合的结果同至少一种预定的标准比较，以便鉴定样品中的微生物。
28．一种用于检测微生物碳源利用的试验，其中该试验包括至少一种碳源和至少一种荧光指示剂，微生物作用于碳源，引起pH改变，pH改变则导致指示剂的荧光改变，这种荧光改变指示该微生物对碳源的利用。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定属于至少二个完全不同微生物群的通用检测系统和方法。此通用检测系统包括一组预定组合的非重复性生化试验，这些试验都包括针对至少一种酶的底物，其中该底物如果受到酶的作用，将导致产生一种可检测性产物。然后，将来自生化试验组合的可检测性产物用于鉴定微生物。
文档编号C12Q1/04GK1228125SQ98800771
公开日1999年9月8日 申请日期1998年3月16日 优先权日1997年4月10日
发明者J·H·戈德塞, D·M·诺塔夫特 申请人:达德微扫描公司