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CRISPR-Cas9 的基因组编辑技术给整个学术界和工业界带来革命性的变化，随之而来的还有CRISPR专利之争。然而，我们知道一项科学技术的发展不是一蹴而就的，往往要经历了前后多辈及多个团队的努力才能有所突破。 科学家报告说，CRISPR技术可实现精确，高效的在活的真核细胞中进行基因组编辑，从那时开始，这项技术像风暴一般席卷科学界，有数以千计的实验室在用它进行生物医药或者农业方面的研究。而这所有的一切都开始于一项微生物的研究…… 古微生物实验的惊奇发现 故事发生在西班牙的科斯塔布兰卡，Francisco Mojica在当地的一个实验室研究古微生物。他发现培养基中的盐浓度影响着限制酶切断该微生物基因组的方式，他决定试着改变这些片段的特征。在他检查的第一个DNA片段中，发现了一个令人惊奇的结构，多份近乎完美的回文结构，重复着30个碱基序列，由大约36个碱基间隔开。之前没有任何微生物是这样的。一开始这个现象被称为短规则间隔重复（SSR），后来在Mojica的建议下，它被叫做Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats（CRISPR）。 但依照Mojica的假说，CRISPR能够参与基因调控、复制子分区、DNA修复以及其他许多功能。但现在大多数的假设都鲜有证据，还有一些被证明是错误的。 荷兰科学家与编程CRISPR John van der Oost是一位荷兰科学家。他和他的同事们将大肠杆菌CRISPR系统插入另一株大肠杆菌中。这让他们通过得到了一个5个Cas蛋白的复合物，称为Cascade。通过单独的敲除每一个组件，他们发现Cascade需要切割很长的前体DNA，要从CRISPR基因转录到61个核苷酸长度的CRISPR RNA （crRNAs）。他们在克隆和测序了一组与Cascade共纯化的crRNAs，结果发现所有的序列都开始于最后8对碱基的重复序列，后面跟着完整的碱基间隔和下个重复区域，这一发现证实了重复的回文序列会导致crRNA二级结构的形成。 为了证明crRNA序列对CRISPR的影响，他们准备创造第一个人造CRISPR阵列，将CRISPR编入λ噬菌体的4个基本基因。正如预想的一样，搭载着CRISPR序列的菌株对λ噬菌体产生了抵抗，这也是第一次直接编程CRISPR。这个结果也暗示了CRISPR的作用目标并不在RNA，而是DNA。 CRISPR“瞄准”DNA的芝加哥学者Marraffini 芝加哥大学学者Luciano Marraffini也确信CRISPR无法通过RNA干扰发挥作用，因为这个机制实在是效率太低，无法克制噬菌体传染时候的爆发式增长。所以他推测，CRISPR肯定是像限制性内切酶那样切割DNA。 Marraffini通过分子生物学的方法，用CRISPR系统修改目标质粒中的内斯基因，在其序列中插入一个自我剪接的内含子。如果CRISPR的目标是mRNA，这项改变就不会产生影响，因为内含子序列会被剪切掉；如果CRISPR的目标是DNA的话，就会产生干扰，因为碱基间隔会不再匹配。结果很清楚：CRISPR“瞄准”的是DNA。Marraffini认为，CRISPR基本上是一个可编程的限制性内切酶，他的论文是第一个明确地预测CRISPR可能在异源系统中被用于基因组编辑。 cRNA引导Cas9生成双链断裂的DNA CRISPR一般来说是非常高效的，以至于根本无法观察到它入侵和破坏DNA的作用机制。Sylvain Moineau和他的同事们观察嗜热链球菌的质粒干扰，发现质粒的切割取决于Cas9核酸。当它们测序线性质粒，一个单一的精确末端切割的PAM序列。经过他们进一步的分析，发现在病毒DNA中切断的位置也是相对于PAM序列的地方。他们研究明确表明了，活性Cas9核酸酶能在特定的编码序列位置上精确地切割DNA。 在哺乳动物中的基因编辑 在20世纪80年代末，科学家们就发明了一种在活体细胞中改变哺乳动物基因的方法，包括在小鼠胚胎干细胞中的特定位置插入DNA，但这些方法都需要对目标进行选择和筛选，效率低下。 因为Marraffini和Sontheimer的论文明确了CRISPR是一个可编程的限制性内切酶，研究人员已经掌握了CRISPR切割特定基因位点的方法。接下来最大的问题就是，如何让CRISPR在哺乳动物的细胞中工作。相比微生物，哺乳动物的基因组是其1000倍，且在细胞核中的一个染色质结构中。因此在2012年9月，专家们对于编辑人类基因组还持着怀疑的态度。 张锋发现在哺乳动物细胞中，虽然缺少微生物中的核糖核酸酶III，也仍然可以处理crRNA。在2012年中，他提出一个稳健的三足鼎立结构，Cas9、tracrRNA和CRISPR阵列。针对在人类和小鼠基因组16个地点，可以高效准确的变异基因删除非同源末端连接，并通过同源重组修复模板插入新的序列。此外，多个基因可同时通过CRISPR阵列来编辑。在2013年1月3号的《Science》上出版了张锋第一篇哺乳动物基因组编辑的报告，它会成为该领域被引用最多的论文。 从2013年初开始，谷歌中“CRISPR”搜索量就一路飙升。在一年之内，研究人员报告了许多生物，包括酵母，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠和猴子使用CRISPR为基础进行基因组编辑。在人类治疗和农业中对其应用前景也开始关注，而且该技术甚至可用于“生产设计”婴儿。 这个故事给我们的启示是，，医学上的突破往往是从完全不可预测的起源涌现。 CRISPR的早期英雄不是在寻求修改人类基因组，甚至是研究人类疾病，而只是因为他们旺盛的好奇心。 参考文献：The Heroes of CRISPR （点击左下角阅读原文了解详情）
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