师姐整理之细胞转染技巧

1、细胞转染有脂质体转染，病毒转染、电转染、磷酸钙法、显微注射….下面主要讲最常用的脂质体lip2000介导的细胞转染。

2、转染效率影响因素：1、细胞种类，细胞状态，2、质粒大小， 3、转染试剂。

3、转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。转染时细胞的密度为50%-80%较好，同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。比如转染质粒到细胞内，48小时后做WB，那么此时细胞的密度最好不要长满. 因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。

4、不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。质粒：脂质体=1：1， 1：1.5， 1：2， 1：2.5， 1：3， 1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例（一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光的只能通过qPCR来检测各组转染效率）。

5、质粒的纯度影响转染效率：1、脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。建议使用QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒。

6、转染时，小心轻柔的将lip2000加到培养基中并轻轻混匀（说明书上的用词为：Mix gently），避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。

7、转染时各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量见下表：

8、虽然现在的大多数转染试剂可以使用带血清的培养基进行转染，但转染时建议用无血无抗生素的opti-MEM培养基提高转染效率。转染后6小时更换培养基，一是lip2000具有一定毒性，二是培养基需要更换成有血清培养基。

9、支原体污染会严重影响细胞转染的效率，且支原体污染不会像细菌污染那么明显可见，转染前可以用环丙沙星杀一杀支原体。

10、转染后效率的检测：1、观察转染后细胞荧光情况。2、qPCR验证。3、WB检测敲减或者过表达蛋白。

11、转染后发现转染效率不高，可以通过两种方法：1、复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。2、通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。

12、附加为常用的几种转染试剂说明书，点击帖子最下方的阅读原文。