【原】分子克隆｜第4期. 做好质粒转染你真的会吗？

转染外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。其中磷酸钙法和脂质体介导法操作流程非常类似，只是所用的转染试剂不同，导致原理和操作细节略有不同，今天我们以脂质体介导法为例，教大家如何用脂质体介导法将我们构建好的携带P53基因的pCDNA3.1质粒转染到293T细胞中。

1. 293T细胞培养

293T细胞采用DMEM高糖培养基进行培养，由于293T细胞增殖速度非常快，通常隔天就要补充培养基或进行传代处理。遐观老师给大家的建议是细胞密度在80%左右时即可进行传代，过高的密度会影响细胞活性，可按1:3-1:20的比例进行传代。1:3的比例通常次日或隔天就能长到80%，如果传代3天没达到预期细胞密度，需要考虑是不是细胞污染或活性不好。

2. 细胞转染之种板

如果是单纯的验证质粒构建是否成功，6孔细胞培养板即可满足要求，6孔板一个孔种板密度在100万左右，以种板后20-24小时，细胞密度达到70-80%左右为宜，此细胞密度下进行质粒转染效率最高。如果因为计数导致细胞密度过密或过稀，转染时间以细胞密度达70-80%为准。附图1A是比较合适的细胞密度(细胞密度可略低于图1A 的20%，不可高于图1A的密度），图1B的细胞密度则略偏低。

3. 质粒转染

组别设置：NC组：可选带EGFP的pcDNA3.1质粒做阴性对照（EGFP的表达情况可以反应质粒的转染效率），实验组：带P53基因的pcDNA3.1质粒。

质粒纯度要求其260/280=1.8～2.0之间，浓度在 0.5–5 ug/uL。转染试剂我们选用invitrogen的Lipo3000，参考Lipo3000使用说明书配置如下转染复合物。

将复合物2滴加到复合物1中，混匀，加入到细胞中。轻轻晃动孔板，确保转染试剂均匀分布。

4. 转染后换液

转染后6h-24h换液，换成正常细胞培养基。培养24h，在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，一般转染效率在80%以上最佳，明确质粒准染效率就可以进入后续质粒表达验证环节。