食用菌病毒及菌种脱毒技术研究概述

    食用菌病毒及菌种脱毒技术研究概述

    食用菌EDIBLEFUNGI2009(5) ;食用茵病毒及菌种脱毒技术研究概述

    ;胡晓艳

    ;(北京市农业技术推广站食用菌室,北京100029) ;摘要概述了食用菌病毒的危害,应用脱毒菌种的优势及制 ;作脱毒菌种的几种方法.可为相关工作者及广大菇农提供一定 ;参考.

    ;关键词食用菌病毒脱毒菌种脱毒方法

    ;文章编号1000—8357(2009)05—0001—03

    ;在食用菌栽培过程中经常会出现菌种退化,质量及产量 ;降低等问题其原因之一可能是病毒病害引起的.病毒病害与 ;细菌,真菌,线虫病害危害不同,其发病症状具有潜隐性,直到 ;生产中的某个时期才开始显症.感染病毒后症状随侵染时问, ;病毒种类,食用菌品种及环境条件不同而有变化.总的来说, ;菌丝体生长缓慢,子实体发育不良,严重影响食用菌的产量和 ;品质[】】.病毒病一旦发生,不但当年的产量下降,如菇房消毒不 ;彻底,各种病害形成交叉感染,生产环境恶化,还会影响下一 ;年的产量,使菇农蒙受巨大的经济损失.

    ;使用无病毒材料是防治食用菌病毒病害有效措施之一. ;在欧美和东南亚国家,无病毒的种苗广泛应用于果树,蔬菜, ;林业,花卉和药材等领域,脱毒技术已使农业大为受益.20世 ;纪80年代以来,我国部分地区也将植物脱毒技术与组织快繁 ;技术相结合,进行了无性繁殖植物的脱毒及快繁生产,取得了 ;可观的经济效益.在食用菌生产中,菌种脱毒技术研究起步 ;较晚,相当一部分菇农受传统意识的影响,对菌种带毒和脱毒 ;缺乏足够认识,技术推广有待进一步加强.笔者就食用菌病毒 ;的相关研究及脱毒菌种的制作技术调查总结,以期对广大食 ;用菌工作者及菇农提供一定参考.

    ;1食用菌病毒

    ;1.1食用菌病毒的种类食用菌病毒是真菌病毒的一部分, ;形状多为球形,也有细菌状和短杆状等.已发现的食用菌病 ;毒有少数几种已经归类,如蘑菇细菌状病毒(MBV),属于 ;Bamaviridae科中Bamavirus属,双孢蘑菇病毒4属于分病 ;毒科的双分体基因组病毒属(Partitivirus).糙皮侧耳病毒I ;(PoVI)与双分体基因组分病毒科(Partitiviridae)的成员相 ;似,特别是与FusariumpoaevirusIstrainAII十分相似【1】.目 ;前研究报道最多的食用菌病毒为蘑菇病毒,香菇病毒及平 ;菇病毒.

    ;1.1.1蘑菇病毒迄今已发现8种蘑菇病毒粒子.其中4种

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    ;球状病毒粒子的直径分别为25nm,29nm,34nm,50nm,两 ;种杆状病毒粒子的大小分别为19nmx50nm,17nmx350nm,

    ;以及两种直径为65nm的螺线形病毒粒子,1种直径70nm的 ;有管状尾部的病毒粒子.梁平彦等从北京,上海,福建收集生 ;收稿日期:2009—07一O1一稿;2009-07—17修改稿. ;长正常与异常的双孢蘑菇的子实体及菌丝进行病毒提取及电 ;镜观察.在感病蘑菇子实体中找到多种病毒颗粒.球形病毒颗 ;粒直径32？34nm较常见,直径25nm及70nm颗粒偶尔可 ;见.两种棒状颗粒,外形与烟草花叶病毒相似.还有长110~ ;160nm的棍棒状颗粒,一端圆形膨大直径35？50nm和一种 ;具有尾状物的颗粒.这两种颗粒和Lesemann,Albouy(1983)

    ;在超薄切片与提取液中发现的严重的蘑菇病害相关的棍棒 ;状,多态性病毒形态相似口71.

    ;1.1.2香菇病毒国内外的研究人员先后从生长不正常的香 ;菇子实体和菌丝体中分离到了包括球状,杆状和蝌蚪状(噬菌 ;体)的病毒颗粒或VLPs.Inouye(1970)首次从香菇菌丝中分 ;离出一种病毒.日本的Ushiyama(1977)在生长不正常的香菇 ;子实体中检测到直径分别为25nm,30nm和39Bill的球状病 ;毒颗粒,以及长度可达150onm易弯曲的长线状和大小为 ;280？300nmx25？28nm的杆状VLpst”.国内的潘迎捷等(1991) ;从染病的香菇菌丝中分离出一种34nm的球状单链RNA病 ;毒颗粒.沈学仁等(1992)从生长不正常的香菇菌丝体中也分 ;离到一种直径为34nm球状病毒颗粒,电镜下观察发现,病毒 ;颗粒表面光滑无外膜,常呈晶格排列.梁振普等(2005)利用差 ;速离心和蔗糖梯度离心技术,从香菇子实体中分离出了一种 ;球状病毒和一种噬菌体,其中噬菌体为国际首次在香菇中发 ;现.

    ;1.1-3平菇病毒我国的学者(1990)在美味侧耳,糙皮侧 ;耳,漏斗状侧耳,佛罗里达侧耳等侧耳属食用菌中发现了病毒 ;病害.美味侧耳中的病毒颗粒可分为球状(619nm,25nm, ;(I)32nm)和杆状(40-600nm~12~14nm)两种,基因组主要由4 ;条dsRNA组成.糙皮侧耳,漏斗状侧耳和佛罗里达侧耳中的 ;病毒粒子为等轴对称病毒,直径为23nrft.通过对感染病毒的 ;糙皮侧耳子实体进行超微结构分析发现,病毒主要分布于子 ;实体层和柄细胞的细胞质或泡囊内,在细胞间的分布不均匀, ;且能通过隔膜孔器进行细胞问易位_引.韩国的YuHyunJae等 ;(2004)采用Tris—EDTA缓冲液提取,PEG—NaC1沉淀和CsC1 ;梯度离心,依据不同的比重获得了3种病毒粒体.其中一种直 ;径27nm的球形病毒,其比重较直径34nm的病毒大,称为平 ;菇球形病毒(OMSV),该病毒含有2条ssRNA片段.直径为 ;34nm的病毒有两种比重小的粒体,其中一种常与OMSV共 ;感染平菇,称为平菇等面体病毒一I(OMIV一1),该病毒含有12 ;条dsRNA片段,另外一种称之为平菇等面体病毒-II(OMIV- ;II),含有3条dsRNA片段.经聚丙烯酰胺凝胶(12%)电泳,考

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    ;马斯量兰染色表明OMSV,OMIV—I和OMIV-II病毒粒体的外 ;壳蛋白的分子量大小分别是29kDa,71kDa和62kDa.这些 ;结果表明在平菇中至少存在3种不同的ssRNA和dsRNA病 ;一

    ;】一

    ;食用菌EDIBLEFUNGI2009(5) ;毒l”J.

    ;1.1.4其他食用菌病毒除了上述食用菌病毒外,在茯苓,银 ;耳,草菇及金针菇中也发现了病毒病害.草菇中的病毒主要是 ;直径23nm的等轴对称粒体,基因组为dsRNA.金针菇中的病 ;毒(FVV)为直径50nm的等轴对称粒体,基因组为dsRNA,分 ;成两个片段,大小分别为1.8kbp和1.9kbp.FVV与金针菇子 ;实体褐变,质量和产量下降相关嘲.

    ;1.2食用菌病毒病的症状与危害美国宾夕法尼亚州La ;France兄弟(1950)在双孢蘑菇菇房中发现了”LaFrancedis— ;ease”

    ;,俗称为法国蘑菇病,褐色蘑菇病等,这是最早报道的食 ;用菌病毒病害l.蘑菇担孢子感染病毒后,其孢子由正常的瓜 ;子形而变成弯月形或菜豆形,直径较正常孢子小,健康菇孢子 ;平均大小为4？6Ixm,病菇孢子平均大小为2m,且细胞壁 ;薄,萌发快;菌种带有病毒则菌丝生长速度减慢,且很稀疏,颜 ;色变褐,菌落边缘不整齐.如用带有病毒的菌种播种,菌丝发 ;菌及子实体分布不均匀,也有不出菇的现象;子实体长出后, ;菌盖菌柄生长不成比例,菌盖小,菌柄细长弯曲,有的菇柄呈 ;球状,菌盖薄而平展,有的菌盖呈半球形,菌柄上粗下细,呈钉 ;头菇.当正常菌种被病毒感染后,多在第2潮菇开始表现症 ;状,病菇越来越多.

    ;香菇母种感染病毒的主要症状表现为菌丝生长不整齐, ;局部伴有缺刻或菌丝紊乱现象,但这些症状较为隐蔽,以潜伏 ;感染为主,一般难以识别.但菌丝体内的代谢活动已受到了严 ;重的抑制,减少了其分泌纤维素酶,半纤维素酶及漆酶等胞外 ;酶的活性,从而降低了分解木屑培养基中的纤维素,半纤维素 ;和木质素的能力,致使出现菌丝生长速度减慢和退化等典型 ;的病症.在多数情况下,症状主要表现在原种及栽培种的菌丝 ;生长后期.杨清香等利用电镜观察检测到不正常生长的香菇 ;菌丝中存在大量直径约30nm的球状病毒,进一步酶解和电 ;泳检测确定病毒的核酸为单链RNA.采用菌丝尖端生长点传 ;代技术,经过3次继代,得到不含病毒的香菇菌株,该菌株在 ;固体和液体培养基中的生长速度都远远高于带病毒的菌株. ;脱除病毒的菌株在液体发酵中产漆酶的量也明显高于带病毒 ;的菌株,说明该香菇病毒对香菇的生长和产酶生理过程有明 ;显的抑制作用f.

    ;平菇病毒病在我国发生于2O世纪80年代,首先在南京 ;发现.该病一般从第2潮菇开始发生,可危害菌柄及菌盖,受

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    ;害菌柄及菌盖有明显的水渍状条纹或条斑;菌柄肿胀呈近球 ;形或烧瓶状,不形成菌盖或形成很小的菌盖,或在近球形的子 ;实体顶面保留菌盖的痕迹,发生后期产生裂缝,露出白色菌 ;肉,导致菌柄变弯和变扁,表面有瘤状突起,菌盖变小并且有 ;畸形现象,有较深的缺刻呈波浪状.该病毒主要靠带病毒的菌 ;种传播,带毒的孢子降落在菇床是发病的主要原因,管理粗放 ;的菇房发病严重.

    ;1.3食用菌病毒检测传统的病毒检测手段主要是电子显 ;微镜观察,dsRNA技术及酶学方法.电子显微镜观察病毒粒 ;子形态是最为可靠的一种方法,但受病毒粒子提纯困难的限 ;制,dsRNA技术是用于检测食用菌病毒最为普遍的方法. ;dsRNA技术是在研究真菌病毒的过程中发展起来的检 ;一

    ;2一

    ;测RNA病毒的技术,具有准确,方便和快捷的优点,是目前检 ;测食用菌病毒最为常用的方法.Morris和Dodds(1979)成功的 ;将dsRNA技术用于植物和真菌病毒的研究中.肖奎(2008)对 ;所采集的87个食用菌菌株进行dsRNA的提取,经1%琼脂糖 ;凝胶电泳分析表明:所检测的87个食用菌菌株中,有26个菌 ;株含有dsRNA,占29.9%.其中平菇类中有16个,占平菇类的 ;38.1%;香菇类有9个,占香菇类的81.8%;其它珍稀菌类1 ;个,占11.1%;不同地理来源和品种的双孢蘑菇,金针菇,鸡腿 ;菇和木耳菌株均未检测到dsRNAt51. ;陈明杰等(1998)应用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 ;泳分析香菇菌丝蛋白质,根据能否检出22000道尔顿的34nm ;香菇病毒外壳蛋白带作为菌株是否带病毒的指标.在生长不 ;正常香菇菌株和对照的带病毒菌株中均检测出了34nm香菇 ;病毒外壳蛋白带.这一结果表明,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶 ;电泳可对香菇病毒进行简单,快速的早期检测.此外,还从具 ;有典型病毒病症状的香菇菌丝体中分离出毒菌株SLV一3进 ;行纯培养,通过对带毒菌株与正常菌株酯酶同工酶及过氧化 ;物同工酶酶谱的比较分析,认为酯酶同工酶酶谱和过氧化物 ;同工酶酶谱比较分析也可以作为香菇菌种是否带毒的早期快 ;速检测指标之一lj.

    ;近年来,随着食用菌病毒的不断发现及研究的深入,血清 ;学及分子生物学等快速检测技术也相继应用于食用菌病毒的 ;检测.目前,以提纯的病毒粒子为抗原,制备出了OMIV, ;OMSV和PeSV的抗血清,并建立了这3种病毒的三抗体夹心 ;酶联免疫吸附测定(rAS—ELISA)快速检测方法;基于已经获 ;得的部分食用菌病毒基因组序列,反转录聚合酶链式反应 ;(RT—PCR)也已成功应用于食用菌菌种,栽培基质,覆土及子 ;实体中病毒的快速检~I1[31.

    ;2菌种脱毒后的优势

    ;脱毒,原意是指采用技术手段或措施,将种苗自身携带的

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    ;病毒分离出去,使种苗纯化,恢复母本性状.在食用菌菌种的 ;脱毒技术研究中,在遵循脱毒操作规程的基础上,通过改变培 ;养基质,有意创造高温,低温以及一系列的不适条件等若干技 ;术手段,迫使菌种的菌丝在恶劣条件下生存,生长,借以恢复 ;其”野性”,同时提高了菌种的抗逆性,大大增强了菌种的抗病 ;能力.近几年来,大量中试及推广实践证明,菌种脱毒后,可 ;“脱”去原菌种所携病毒,恢复菌株原来的生物特性,保持品种 ;的纯正,使之菌丝健壮,旺盛,浓密,抗性提高,包括对温度,湿 ;度等外界环境条件的抗性,以及以某些人为因素,如通风不良 ;生长条件的抗性等.从生产调研结果分析,现有的脱毒菌种用 ;于栽培生产后,总体发病率大幅度降低,生物转化率有了明显 ;提高.许襄中等(1994)对平菇带毒菌株进行的脱毒试验表明, ;P56和P59两个带毒菌株由显现典型病毒症状的单菇组织分 ;离后,经采用挑取尖端菌丝,高温连续继代培养4次的处理后 ;比对照分别增产15.4%和17.4%.而且症状消失,子实体原基 ;提前3~8d出现12].曹令花等(2003)报道,”黑平l19”可在2— ;32?条件下出菇,但经连续生产后,当气温达30?时即表现出 ;菌盖薄,小,脆以及产量极低的不理想状况,严重时25?时就 ;食用菌EDIBLEFUNGI2OO9(5) ;难以出菇.经脱毒处理后,其在33cc高温条件下仍能产出色 ;深朵大,菌盖较厚的子实体,产量较未脱毒的菌种高80%以 ;上.

    ;3菌种脱毒方法

    ;菌种脱毒常采用的是”尖端”脱毒理论,其基本依据是随 ;着生物体细胞的不断分裂,生物体自身才能不断生长,其末稍 ;组织与生物体自身携带的病菌,病毒之间的距离较大,因此适 ;时及时地进行分离操作,便可达到脱去病毒的目的.菌种脱毒 ;的操作本身并不复杂,但需花费较长时间,并需严格控制脱毒 ;时机和操作旧.它不同于组织分离技术,严格说来,一般组织分 ;离并不能达到菌种脱毒的目的,这是由于子实体已生长至中 ;后期,携带病毒菌的概率相当高,故效果不明显. ;具体脱毒方法有以下几种,所用原理基本相同,但操作有 ;所差异,生产实践中可根据实际情况进行选用. ;3.1四循环微控脱毒技术山东省农科院土肥所曹德宾借 ;鉴马铃薯等作物的脱毒技术,成功探索出了”食用菌菌种四循 ;环微控脱毒技术”.此技术能有效预防食用菌生产过程中出现 ;的大部分病害.具体操作为:将现有菌种或现有子实体转接试 ;管或培养皿(25oC培养),第1次接入二级种(常规基质,15？ ;30?调节温差),分离转接试管或培养皿(25?培养),进行尖端 ;分离(25?培养)后再次接入二级种(调配贫瘠基质,15~30~C调 ;节温差),重复进行分离转接试管或培养皿(25?培养),尖端分 ;离(25?培养),第3次接入二级种(常规基质,15-30~C调节温 ;差),分离并转接试管(25?培养).经试验确认达到目标要求 ;后,该菌种即为F级(原始)脱毒菌种叫.

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