|
引用本文: 王翔, 杨帆, 管震, 等. 负压封闭引流术减轻兔骨骼肌缺血再灌注损伤的作用机制研究 [J]. 中华外科杂志,2016,54( 4 ): 292-296. 作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科 骨骼肌的缺血再灌注损伤(ischemia－reperfusion injury，I/R)在临床工作中并不少见，其机制研究和防治方法备受重视[1]。大量研究资料表明，减轻由免疫介导、炎症细胞浸润、氧化应激导致的组织损伤，在组织缺血再灌注损伤中具有保护作用[2]。我院创伤外科利用负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)技术治疗肢体创伤取得了良好效果，但该技术对骨骼肌作用的相关研究鲜有报道。基于此，我们采用缺血再灌注损伤动物模型，来探讨VSD技术在骨骼肌损伤中对氧自由基和炎症介质的清除作用，以阐明其在减轻/预防骨骼肌缺血再灌注损伤中的可能作用机制。 材料与方法 一、实验动物与分组 雄性新西兰白兔30只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，体重2～3 kg，试验前适应培养1周后随机分为3组，即对照组、缺血再灌注组(I/R组)、VSD干预的缺血再灌注组(I/R＋VSD组)，每组10只。 本研究所涉及的实验动物饲养与科学实验操作均符合《实验动物管理条例》。 二、骨骼肌缺血再灌注模型的制备 将新西兰白兔分别称重后按照150 mg/kg的剂量，耳缘静脉注射盐酸氯胺酮注射液，麻醉成功后固定于操作台。缺血再灌注损伤模型制备：取白兔左后腿中部以上的皮肤剃毛消毒后剪开，于大腿根部游离股动静脉并予以保护，大腿中上水平切断所有肌肉及神经，将离断的肌肉进行原位缝合，使左下肢成为仅通过股动静脉及骨骼与肢体链接的组织块；使用无创伤血管夹阻断股动静脉造成下肢缺血(持续4 h)，然后放开血管夹，造成再灌注损伤(持续6 h)。对照组动物仅完成组织游离，不进行左下肢静脉的夹闭及开放。I/R＋VSD组的动物在进行再灌注的同时予以VSD干预。各组实验结束后，将白兔处死取相应部位组织进行生化指标测定和组织学分析。 三、生化指标采集与测定 使用冰去离子水对获取的白兔左下肢骨骼肌组织进行冲洗并进行匀浆处理，使用低温离心机以3 000 r/min离心10 min，取上清分别进行髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶(cata－lase，CAT)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的测定，实验操作严格按照试剂商提供的标准进行。 四、病理学检测 取腓肠肌近端1/4处的肌肉组织，4%中性甲醛固定肌肉标本1周，送往华中科技大学同济医学院病理学实验室进行HE染色和免疫组化处理。对骨骼肌组织的HE染色切片进行随机拍照，通过Image－Pro Plus 6.0软件计算肌肉组织间隙面积比，间隙比数值越大说明肌肉水肿程度越严重；对免疫组化切片拍照的视野进行阳性细胞比例(阳性细胞数/总细胞数)分析，评估HMGB1的阳性细胞表达情况。 五、骨骼肌细胞HMGB1 mRNA的分析 采用实时定量PCR进行分析。HMGB1上、下游引物：5'－CTGGCTTATCCATTGGTGATGT－3'，3'－CCTTTAGCTCTGTAGGCAGCAA－5'；内参GAPDH上、下游引物：5'－CAACTCCCRCAAGATTGTCAGC－AA－3'，3'－GGCATGGACTGGTCATGA－5'。使用SYBR Green Ⅰ试剂盒进行核酸定量分析，PCR程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、70 ℃延伸12 s，35个循环后70 ℃延伸5 min，熔解曲线绘制范围为77～92 ℃。设立标准参照，特异基因HMGB1的核酸含量参比GAPDH的含量进行计算。 六、骨骼肌细胞中HMGB1的蛋白表达分析 取漂洗干净的骨骼肌组织，提取总蛋白进行15% SDS－PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜后依次加入鼠抗HMGB1单抗和HRP标记的羊抗鼠IgG，使用化学发光法进行显色。本实验引入GAPDH蛋白作为内参，采用免疫印迹法检测蛋白表达情况。 七、统计学方法 所有数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以 结果 一、生化指标水平(表1) 在建模过程中，I/R组和VSD组各有1只白兔死亡。与对照组比较，I/R组MPO和MDA表达水平显著增高(t＝7.142，P<>t＝2.707，P＝0.019)，抗氧化作用因子SOD、CAT和GSH的组织含量明显降低(t＝2.962，P＝0.009；t＝4.408，P<>t＝2.841，P＝0.015)；与I/R组比较，VSD干预组的MPO和MDA含量显著降低(t＝4.657，P<>t＝2.293，P＝0.041)，SOD、CAT和GSH的组织含量增加，其中SOD和GSH差异明显(t＝2.511，P＝0.023；t＝2.766，P＝0.017)而CAT的差异无统计学意义(t＝1.995，P＝0.062)；VSD组与对照组相比，仅MPO和CAT的表达水平有差异(t＝2.668，P＝0.016；t＝2.491，P＝0.023)。 二、骨骼肌组织病理学评估 通过软件分析间隙比可知，I/R组组织间隙所占面积比例最大，与VSD干预组和对照组比较差异有统计学意义(F＝16.47，P<0.05)(图1)。对各组动物的骨骼肌组织进行hmgb1的免疫组化观察，对照组hmgb1主要在细胞核中呈弱阳性表达，细胞质中未见；i>F＝853.886，P<0.01)，两两比较显示，i>t＝39.027，P<0.01)及i>t＝28.066，P<>
光镜下观察各组白兔骨骼肌间隙面积(HE染色 ×200)：1A为缺血再灌注损伤组(I/R组)；1B为缺血再灌注损伤＋负压封闭引流组(I/R＋VSD组)；1C为对照组 图2 光镜下观察各组骨骼肌组织中HMGB1的表达图像(免疫组化染色 ×200)：2A为I/R组；2B为I/R＋VSD组；2C为对照组 三、HMGB1的mRNA表达水平 荧光定量PCR的检测结果显示，I/R组和I/R＋VSD组HMGB1 mRNA的相对表达量分别为对照组的5.9倍和2.1倍，组间差异有统计学意义(F＝50.653，P<0.01)。其中i>t＝4.515，P<> 四、HMGB1的蛋白表达水平 免疫印迹法检测结果显示，对照组、I/R组和I/R＋VSD组HMGB1蛋白相对灰度比分别为0.097±0.028，4.569±1.459和0.662±0.104，即I/R组HMGB1的表达水平是VSD组的6.9倍，是对照组的47.1倍(图3)。方差分析结果显示，三组相对表达量不完全相同(F＝963.489，P<0.01)，其中i>t＝32.537，P<0.01)，而i>t＝28.117，P<> 图3 免疫印迹法检测骨骼肌细胞中HMGB1表达的电泳图像 讨论 骨骼肌是受缺血再灌注影响最敏感的肢体组织，也是缺血再灌注损伤机制和预防干预研究的重点。Kloner等[3]研究发现，缺血组织的内皮细胞在恢复供血后的最初几分钟内会加速释放活性氧，从而造成组织中氧自由基和炎性因子的迅速堆积，这是再灌注损伤的主要阶段。因此，再灌注发生之前即应采取预防缺血再灌注损伤的措施。但骨骼肌组织损伤多属于不可预知的急性创伤，使用药物进行预防和保护难以达到预期目的。VSD技术对创面和组织具有良好的引流作用，可以去除组织内的损伤因子，调节炎症反应，确保再灌注期间骨骼肌组织细胞能够得到有效保护[4,5,6]。 骨骼肌缺血再灌注损伤中，活性氧和激活态的中性粒细胞是促使损伤发生的主要因素，前者具有高度活性和细胞毒性，可诱发组织细胞膜产生脂质过氧化反应，进而破坏细胞生理功能导致细胞死亡，其中MPO浓度可反映组织中中性粒细胞浸润程度，MDA则反映组织细胞氧化损伤的程度[7,8,9]。在本研究中，I/R组的MDA和MPO水平明显高于VSD干预组(P<>P<> 活性氧的氧化作用在导致组织细胞损伤时可触发细胞的防御系统，其中最重要的防御机制是抗氧化酶SOD、CAT和GSH的抗氧化作用。在药物治疗骨骼肌缺血再灌注损伤的研究报道中，抗氧化酶浓度升高的同时伴随组织受损程度的降低[10]，但尚未见VSD治疗方面的相关文献。在本实验中，VSD治疗组的SOD、CAT和GSH水平均高于I/R组(P<> 在组织缺血再灌注损伤中，机体免疫细胞由于暴露于损伤相关模式分子而被激活，进而通过释放细胞因子、启动相关信号转导通路对组织细胞造成免疫损伤[11,12]。HMGB1是一种DNA结合蛋白，有研究结果表明其可作为分子标志，来评估骨骼肌缺血再灌注损伤后组织炎症反应或炎症抑制的情况[13,14,15,16]。我们对各组模型骨骼肌中HMGB1的阳性表达细胞进行相对定量分析，I/R组的HMGB1阳性细胞平均比例可达63.36%，高于VSD组和对照组(F＝853.88，P<0.01)。该结果在基因和蛋白表达分析中得到进一步验证：实时定量pcr结果显示，i>F＝50.653，P<0.01)；免疫印迹法检测结果显示，hmgb1在i> 在对VSD减轻骨骼肌缺血再灌注损伤的研究中，我们还利用HE染色的病理切片结果对骨骼肌组织水肿情况进行评估。正常骨骼肌组织中骨骼肌细胞排列紧密有序、细胞间隙均一。通过软件分析细胞间隙面积比，I/R组骨骼肌细胞间的面积大于VSD组和对照组(F＝16.47，P<> 综上所述，我们利用VSD技术对骨骼肌缺血再灌注损伤模型进行预防性干预，证实了VSD可通过降低骨骼肌缺血再灌注损伤过程中活性氧浓度、增加细胞抗氧化酶的表达、减少炎性介质因子HMGB1的表达和释放等机制降低I/R对骨骼肌的损伤，促进组织修复。 （参考文献略） |
|
|
±s表示。统计分析前先行数据正态性及方差齐性检验；3个试验组组间比较采用单因素方差分析；之后的两两比较采用LSD法(确定方差齐性)或Tamhane's T2法(未确定方差齐性)。以P<>
