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循环肿瘤细胞在肺癌诊断及预后中的应用 作者及其单位：丁浩、钟理、沈志高、李昊（河北大学生命科学学院生物芯片研究室）；王志强（中国21世纪议程管理中心） ［摘要］肺癌的传统诊断主要依赖于常规病理组织学检查和影像学手段，难以实时监测肿瘤的转移和复发。循环肿瘤细胞(CTCs)作为一种代表原发性肿瘤的“液态活检标本”，有助于实时、无创性地进行组织学鉴定。CTCs的数目与肿瘤发展状况呈正相关。因此，CTCs检测可能成为肺癌早期诊断、监测肿瘤复发与转移的一种重要手段。同时，CTCs也可用于评估肺癌的疗效和预后。CTCs在血液中含量极少，为了使检测的灵敏性达到临床可接受的水平，需先富集再检测，几种检测方法各有利弊，在临床上可以将其联合使用，以期计数结果更为准确。
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。肺癌的传统诊断主要依赖于常规病理组织学检查和影像学手段(X线片、CT、B超等)。影像学的方法只能发现直径≥1cm(约1g，109个癌细胞)的结节，而存在于循环血液中的癌细胞和其他器官中的微小转移灶则不能检测。由于诊断手段的限制，肺癌的5年生存率不容乐观(仅为15%)，大多数患者确诊时已发展到中、晚期，有创检查则会造成伤害。如果肺癌在发生早期就能诊断并完全切除，5年生存率将会提高到67%。因此，亟需一种实时、有效、无创的检测手段，进行肺癌的早期诊断和预后评估。
1．肺癌循环肿瘤细胞概述 循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells，CTCs)定义为转移性癌症患者外周血中存在的与原发肿瘤类似的细胞，由Ashworth于1896年首次发现。这些转移的CTC与原发灶的肿瘤细胞相似，故CTCs可以代表原发灶，作为“液态活检标本”实时、无创地评估病情，制定相应的治疗方案。
2．肺癌CTCs的检测方法 2. 1 基于先免疫后富集检测方法 以免疫磁珠分离法进行富集。血液中CTCs的数量极少(1/109)，为了使检测的灵敏性达到临床可接受的水平，必需对其先进行富集。免疫磁珠分离法是最常用的CTC富集技术，原理是用单克隆抗体包被磁珠，抗体与上皮细胞标记物(如EpCAM)结合富集CTCs。采用阴性富集的方法能将富集效率提高1×103～1×104倍。该法通过去除无关细胞，使CTC得到纯化。阴性富集一般选择结合CD45抗体的磁珠，这样可去除血液中大多数白细胞。该法特异性高且不影响细胞活性，能高效地从外周血细胞中筛选出肿瘤细胞。 2. 1. 1免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)其原理是将抗体用显色剂(如荧光素、酶、同位素等)标记，与特异性肿瘤标记物(包括上皮细胞膜特异性抗原、上皮细胞角蛋白CK等)结合，显色的则为肿瘤细胞。该法不仅可以定性循环肿瘤细胞，还定量瘤负荷。通过分析，可以对癌症患者进行个性化治疗。该法的优点是能进行形态学分析，缺点是检测的细胞量少，敏感性不高，约1/105～106。因此，单一的免疫细胞化学法对循环肿瘤细胞的检测没法达到临床的需要，需要结合其他方法(如免疫磁珠技术)共同检测。 2. 1. 2 CellSearch TM系统 是惟一被美国食品和药物管理局(FDA)批准应用于临床检测患者外周血中CTCs的方法，是目前国际上最为稳定和可靠的CTC检测系统。CellSearch TM系统主要由AutoPrep系统和Analyzer系统组成。前者处理血样，后者扫描和分析样本。AutoPrep系统能够实现复杂样本处理流程的自动化和标准化。Analyzer系统是一种荧光光学系统，可对经过免疫磁性分选式呈现备选的荧光检测图像，最终将细胞CD45－、CK+ EpCAM+、细胞直径大、细胞核形状不规则、呈颗粒或点状不均一染色、核仁大或多个核仁改变者认定为CTCs。该方法的缺点是低表达或不表达EpCAM的肿瘤细胞，无法富集。最近，抗CD146抗体用于EpCAM阴性CTCs的检测，同样能检测出预后差的EpCAM阴性的肿瘤患者。 2. 1. 3 CTC-Chip 第一代CTC芯片的基础是微流体学。在一张规格与标准载玻片相同的硅片上覆盖8万个显微位点，每个位点都包埋了能够捕获CTC的抗体。当血样流过微流芯片时，这些位点捕获CTC。该设计造价高，且与抗体覆盖位点接触的CTC数量很大程度上取决于显微位点周围的血流通畅性。Nagrath等发现，CTC-chip比CellSearch TM系统分离纯度高100倍，利于分子生物学方面的检测。第二代微涡字形芯片(HB-chip)为使样品流体迅速充分混合，设计了一种小室流动槽，明显提高了捕获CTCs的数量。将微芯片装在载玻片上，增加血样的处理量，提高了CTCs的捕获率。利用标准的病理检测方法进行鉴别，提高了捕获稀有CTCs的能力及检测结果的准确性。但由于仍局限于用EpCAM筛选CTCs，可能会出现假阳性。 2. 1. 4流式细胞分析 原理是利用荧光抗体结合CTCs，使CTCs染色，然后用流式细胞仪分析，将着色细胞视为阳性，检出率为1/105。其优点是测量速度快，可对CTCs定量计数，能测定细胞形态，并对同一细胞做各种特性的多参数分析。缺点是流式细胞术检测癌细胞的价值主要依靠可分析的细胞总数量，其敏感性较低。大约需要50ml的外周血才能检测瘤负荷，要提高其检测CTCs的敏感性，需采用免疫磁珠细胞分选技术进行富集。近年来，Georgakoudi等发明了活体流式细胞仪，这是一种结合了活体高速实时影像法和体外流式细胞仪的一种新型生物医学光学仪器，可实时检测活体CTCs水平。此法主要的特点是无需抽血，属微创诊断法。 2. 1. 5酶联免疫斑点法(enzyme-linked epithelial immunospot assay，ELISPOT) 该方案对分离得到的CTCs进行24～48h短期培养，在此过程中CTCs会产生一些与侵袭、转移、脱落相关的蛋白质，蛋白质与包埋在培养皿底部的荧光抗体结合，通过检测荧光间接检测出CTCs，用免疫磁珠分选去除CD45阳性细胞，富集得到肿瘤转移相关蛋白(CXCR4)阳性细胞，进一步检测分泌特异性蛋白的CTCs。现在EPISPOT方案已应用于临床外周血和骨髓来源的CTCs检测。 2. 1. 6反转录聚合酶链反应(reverse-transcriptase PCR，RT-PCR) 该方法检测CTCs的原理是，肺癌中特异性mRNA表达。由于RT-PCR法检测肿瘤特异性分子具有高度的敏感性(每106－107个血细胞中能检测出1～10个肿瘤细胞)，较免疫组化灵敏至少100倍。因此，RT-PCR是最常用于检测CTCs的方法。其缺点在于选择合适的目标基因比较困难，样本污染容易造成结果假阳性，检测时需要裂解细胞，限制了CTCs的下一步使用。而且由于RTPCR检测CTCs特异性不高，该法应用于临床诊断的价值受到很大限制。为解决这些问题，产生了定量反转录聚合酶链反应(QPCR)、荧光定量反转录聚合酶链反应(FQ-PCR)等新技术。有研究表明，免疫磁珠结合RT-PCR技术检测CTCs，能克服单独使用RT-PCR技术时存在假阳性和假阴性的缺点。 2. 2 基于过滤作用的检测方法 ISET(Isolationby size of epithelial tumor cells)法基于CTCs与血细胞大小和可变形性的不同进行分离。通过过滤作用可以将CTCs(＞8μm)与血细胞分开。用该法已成功地在非小细胞肺癌患者的外周血中检测到了CTCs。ISET使用简单又廉价的聚碳酸酯过滤器富集CTCs，可以将间质细胞等失去上皮细胞特征的CTCs分离出来。据报道，在临床试验中ISET法对转移性肺癌CTC检测的灵敏度已经高于传统的EpCAM CellSearch TM系统。 2. 3 联合检测 在肿瘤的转移潜能从上皮—间质过渡的过程中，各种上皮细胞标记物(如EpCAM)下调以增加肿瘤细胞的侵袭性，CellSearch TM系统等以免疫磁珠分离为原理的检测技术，会由于EpCAM表达的减少使检测到的CTCs比实际数目少，因此基于抗原抗体反应的CTCs检测技术难以稳定、准确地分离肺癌所有分期的CTCs，结合使用ISET法能弥补CellSearch TM系统的不足。 首先用ISET法，基于CTCs与血细胞物理特性的差异，分离出CTCs，以提高检测的敏感性；然后用Cellsearch TM系统(基于免疫磁珠分离的方法)，通过与上皮细胞黏附因子结合富集CTCs，以提高检测的特异性；最后将两种方法分离富集的CTCs计数后，用免疫组化的方法加以评定，以排除假阳性的干扰，使检测结果更为准确。免疫组化常用的标记物为细胞角蛋白、Ki-67等。这样联合检测确定的CTCs数目，可作为肺癌诊断和预后评估的一个有效的独立标记物(表1)。
3．CTCs在肺癌诊断中的应用 传统影像学手段只能检测出直径＞1cm的肿瘤结节，而肿瘤在发展到0.1cm的情况下，外周血就已经能查到CTCs。故CTCs对于肺癌的早期诊断至关重要。通常以每7.5ml外周血中CTCs的数目进行计数，CTCs的数目与肿瘤的分期呈正相关。Feng等以49例NSCLC作为研究对象，设立健康对照组20例，结果显示20例对照组均未检测到CTCs；而在5例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC中CTCs数目为0.4±0.55，14例Ⅲ期NSCLC中CTCs数目为16.86±16.75，30例Ⅳ期NSCLC中CTCs数目为18.33±21.32。Allard等采用CellSearch TM系统检测了99例肺癌(主要是NSCLC)外周血中的CTCs，发现数目≥2、≥5、≥10和≥50者分别为20%、14%、10%和6%。随后Nagrath等用CTC-chip检测了55例肺癌的CTCs，结果均检测出＞5个CTCs，CTCs数目为≥5、≥21、≥51和＞100，阳性率分别为20%、20%、20%和40%。Tanaka等利用CellSearch TM系统比较125例肺癌和25例良性肿瘤的CTCs阳性率，发现肺癌(30.6%)的阳性率明显高于良性肿瘤(12%)。研究者以144例肺癌作为研究对象，并设健康对照组35例，良性肺疾病组28例，临床结果显示肺癌组与良性肺疾病组、健康组CTC检测结果差异显著(表2)。 外周血中CTCs的数目变化可以指导疗效评估。Matthew等对101例Ⅲ期或Ⅳ期NSCLC患者进行标准化疗，分别抽取治疗前后血样检测CTCs，结果发现Ⅳ期的CTCs数明显高于ⅢB或ⅢA期；治疗前CTCs≥5个与CTCs＜5个的患者相比，其中位OS及PFS缩短，提示不良预后。若化疗1个周期后CTCs仍≥5个，说明该方案不敏感。Hofman等用ISET技术检测到NSCLC患者CTCs升高，显示不良预后。同样，CTC在SCLC的临床研究中也出现相似的结果。Naito等对51例确诊的SCLC分别检测基线水平及治疗后CTCs的数目，研究结果表明，CTCs≥8个与CTCs＜8个的患者相比，其生存期均缩短。近期研究显示，采用CellSearch TM系统检测局限期SCLC患者CTCs的数量，可以实时对化疗过程和预后进行评价。局限期CTCs数目为0～220个，广泛期CTCs数目为0～14040个，1个周期的化疗后CTCs数量的降低是强烈而独立的预后因素。CTCs的分子分析和数目变化可以预测肺癌的复发转移。Rolle等发现，NSCLC术后CTCs的升高会增加复发的风险。CTCs中异常基因的检测指导分子靶向药物的个体化治疗。在NSCLC中，原发灶标本检测EGFR呈阴性，病情恶化后，在CTC中检测到EGFR发生突变，使用靶向药物吉非替尼治疗后，患者生存期延长。因此，通过实时检测CTCs的数目和分子特性可以反映病情变化，调整治疗方案，指导个体化治疗。 此外，研究者指出肺癌CTC的数目可能与年龄相关。Racila等通过流式细胞仪检测患者术前和预后CTC数目的变化，为了提高结果的特异性，使用了肺癌特异性抗体，偶然间发现，相同病理分期的患者术后＜55岁的CTCs数目较＞55岁更多。 多因素分析表明，CTC在治疗前后都是肺癌强烈而独立的预后因子。 综上所述，循环肿瘤细胞在肺癌的诊断和预后方面具有极其重要的意义，其无创便于动态检测等优点给肿瘤患者的诊断带来了新的希望。它将成为体外实时监测疗效、分析癌症突变基因型、建立治疗方案的一种极具价值的工具。但是，循环肿瘤细胞的检测手段都各有局限性，造成其敏感性和特异性不高，还需努力寻找方法使之完善，尽快地应用到临床诊断中。 （参考文献略，有需要者请查看原文章） 本文转自《诊断病理学杂志》J Diag Pathol--2015年2月第22卷第2期 【本订阅号为非盈利学术交流媒体，所有文章均会标注作者和出处，如有转载文章涉及版权问题，请版权所有者及时联系管理人员，我们将第一时间删除该文章，对已造成的损失，我们深表歉意！】 |
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