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创伤性脑损伤是严重威胁人类生命的临床急危症，重型脑损伤的死亡率高达30%～50%, Chrysostomou等[1]的研究认为α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪啶具有神经保护作用，但其机制尚未完全阐明。S－100β蛋白是神经损伤的特异性标志物，与脑损伤程度密切相关[2,3]，而颅脑外伤灶及其邻近脑组织炎性反应是引起继发性脑损伤的关键因素之一[4,5]，本研究拟评价α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪啶对大鼠脑损伤后脑组织肿瘤坏死因子α(TNF－α)、白细胞介素6(IL－6)及血中S－100β蛋白的影响，探讨其减轻脑损伤的机制。 材料与方法 1．一般材料： 清洁级健康成年雄性SD大鼠，周龄为11～13周，体质量(237±31)g，购于河南省实验动物中心；右美托咪啶由江苏恒瑞医药股份有限公司提供；TNF－α和IL－6酶联免疫检测试剂盒由美国Sigma公司生产；S－100β蛋白酶联免疫检测试剂盒为生理教研室产品。 2．实验分组： 72只大鼠按照数字表法随机分成3组，即假手术组(S组)、脑外伤对照组(C组)和α2肾上腺素能受体激动剂处理组(D组)，每组24只；每组再根据伤后生存时间按数字表法随机分为术后6、12、24及48 h共4个亚组，每个亚组均为6只。 3．动物模型建立： 采用改良Feeney法制造大鼠脑损伤模型[6]。大鼠称重腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，仰卧位行股动脉分离穿刺置管术，连接测压转换器监测平均动脉压(MAP)及采血用，然后俯卧位固定，消毒后在大鼠矢状正中线处切开头皮，分离骨膜，于左侧头顶部前囟后2 mm中线旁1.5 mm处钻一直径为5 mm的骨窗，显露硬脑膜，保持硬膜完整，在硬脑膜上放置与骨窗大小相称的垫片，将之置于自由落体底部，采用50 g砝码从30 cm高处滑下撞击大鼠左侧头顶骨窗的垫片，使硬膜伤面积约1 cm2，下陷深度约2 mm。S组仅行头部开窗手术，不做头部撞击；D组致伤后即刻经颈总静脉注射α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪啶负荷量3 μg/kg，20 min输注完成，再以3 μg·kg－1·h－1的速度经颈总静脉继续输注2 h，总剂量为9 μg/kg，总体积为4 ml[7]；C组在相同的时间点采用相同方法注射0.9%氯化钠4 ml。 4．检测指标： 各组大鼠分别在伤后6、12、24和48 h经股动脉取血2 ml，4 ℃、2 368×g离心15 min，取上清分装后于－70 ℃保存待检，采用ELISA法测定血清S－100β蛋白含量；各组采血后立即断头取视交叉前脑组织中脑皮质加入等渗盐水，于低温下制备匀浆，离心后取上清液1 ml，－70 ℃保存备用，采用酶联免疫法测定脑组织上清液中TNF－α、IL－6水平，各项操作严格参照说明书。 5．神经功能缺陷评分测定： 于模型制备后24和48 h各取5只大鼠进行神经功能缺陷评分，包括测试反应、警觉性、协调运动能力，总分为10分。 6．Morris水迷宫实验： 于模型制备后24和48 h各取5只大鼠，将其随机放入1个象限，面向池壁，记录其60 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)，如90 s内未找到平台，则其逃避潜伏期为91 s，测定5次，取其平均值。 7．统计学方法： 采用SPSS 17.0软件分析，正态分布的计量资料以 结果 1．脑组织TNF－α含量： S组大鼠在伤后6、12、24和48 h脑组织TNF－α含量差异无统计学意义(F＝1.147，P>0.05)；C组脑组织TNF－α含量在伤后6、12、24及48 h比S组高；D组脑组织TNF－α含量在伤后6、12、24、48 h比S组高，比C组低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，结果见表1。
表1 3组大鼠各时间点脑组织肿瘤坏死因子α含量的比较(pg/mg，
注：S组：假手术组；C组：脑外伤对照组；D组：α2肾上腺素能受体激动剂处理组；与S组相应时间点比较，aP<0.05；与C组相应时间点比较，bP<0.05 2．脑组织IL－6含量： S组大鼠在伤后6、12、24、48 h脑组织IL－6含量差异无统计学意义(F＝1.176，P>0.05)；C组脑组织IL－6水平在伤后6、12、24、48 h比S组高；D组脑组织IL－6水平在伤后6、12、24、48 h比S组高，比C组低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，结果见表2。
表2 3组大鼠各时间点脑组织白细胞介素6含量的比较(pg/mg，
注：S组：假手术组；C组：脑外伤对照组；D组：α2肾上腺素能受体激动剂处理组；与S组相应时间点比较，aP<0.05；与C组相应时间点比较，bP<0.05 3．血清S－100β蛋白水平： S组大鼠在伤后6、12、24、48 h的血清S－100β蛋白水平差异无统计学意义(F＝1.045，P>0.05)；C组血清S－100β蛋白水平在伤后6、12、24、48 h比S组增高；D组S－100β蛋白水平在伤后6、12、24、48 h比S组高，比C组低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，结果见表3。
表3 3组大鼠各时间点血清S－100β蛋白水平的比较(μg/L，
注：S组：假手术组；C组：脑外伤对照组；D组：α2肾上腺素能受体激动剂处理组；与S组相应时间点比较，aP<0.05；与C组相应时间点比较，bP<0.05 4．神经功能缺陷评分和逃避潜伏期： 模型制备后24和48 h，与S组相比，C组和D组神经功能缺陷评分高，逃避潜伏期延长，C组高于D组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，结果见表4。
表4 3组大鼠模型神经功能缺陷评分和逃避潜伏期比较(
注：S组：假手术组；C组：脑外伤对照组；D组：α2肾上腺素能受体激动剂处理组；与S组相应时间点比较，aP<0.05；与C组相应时间点比较，bP<0.05 5．输注右美托咪啶时大鼠心率和血压的变化： D组在输注右美托咪啶后心率和血压与输注前相比差异无统计学意义，与同时间点S组、C组的心率和血压相比差异均无统计学意义。结果见表5。
表5 3组大鼠心率和血压的变化(
注：S组：假手术组；C组：脑外伤对照组；D组：α2肾上腺素能受体激动剂处理组；1 mmHg＝0.133 kPa 讨论
本研究参照文献[6]制作脑创伤模型，当发生脑损伤时，神经元细胞损伤坏死越严重则血清S－100β蛋白水平越高[2,3]，因此可以根据中枢神经系统损伤的特异性指标S－100β蛋白来判断脑损伤的程度。本研究结果显示，脑外伤后的C组和D组血清S－100β蛋白水平在伤后6、12、24、48 h均比S组显著增高，说明模型制备成功。 脑损伤常引起继发性的脑缺血、缺氧，导致脑损害加重，且多伴有较严重的后遗症[8]，其继发性损伤的机制主要为起始阶段的炎性反应，继而激活免疫活性细胞，释放大量免疫介质，这一级联反应一旦激活就会加重创伤性脑实质损害，而与其密切相关的炎性介质包括TNF－α、IL－6以及IL－1β等[9]。TNF－α由巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和淋巴细胞产生，主要参与免疫和炎症反应，是中枢神经系统损伤后最早出现的细胞因子，并且表达水平会迅速升高，并贯穿颅脑损伤的整个过程，也是最早参与脑外伤后炎症反应的多效细胞因子，可对机体起防御作用，但过度表达则会引发神经细胞肿胀变性、坏死，从而加重继发性脑损伤[10,11]。IL－6也是一种与中枢神经系统炎症有关的细胞因子[12]，在中枢神经系统内主要由胶质细胞合成分泌，参与免疫反应、血细胞生成以及应激反应等，在机体防御体系中起重要作用，颅脑损伤急性期IL－6水平会显著升高，参与继发性脑损伤的过程，且与脑损伤程度呈正相关，故本研究将二者结合起来评估大鼠脑组织的炎症反应状况。 右美托咪啶是一种新型的高效选择性的中枢性α2肾上腺素受体激动剂，除具有镇静、镇痛、抗焦虑作用外，最新研究发现其能保护脑组织，具有显著的神经保护作用[1]。本实验结果显示：假手术组各项指标在各时间点无明显变化，脑外伤组在伤后6、12、24、48 h S－100β蛋白、TNF－α和IL－6均高于假手术组，且呈上升趋势，而右美托咪啶组均比脑外伤组低，说明右美托咪啶能减少脑损伤时S－100β蛋白的产生，抑制了血清炎性因子TNF－α和IL－6的释放，减少了神经元损伤，减轻了继发性脑损伤，通过神经功能缺陷评分和逃避潜伏期比较亦可推测右美托咪啶具有脑保护作用。Ma等[13]的研究发现，右美托咪啶主要通过与α2肾上腺素受体亚型结合，起神经保护作用，其作用机制可能与右美托咪啶具有抗炎作用有关，药物激动神经元突触前α2肾上腺素能受体，通过G蛋白介导，抑制钙离子内流和磷脂酶C的活性，降低血浆儿茶酚胺浓度，降低交感神经张力，增强副交感神经效应而抑制炎性反应，发挥抗凋亡效应，改善血脑屏障通透性，从而减轻大鼠脑损伤。总之，α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪啶可抑制大鼠脑损伤导致的炎性反应，具有脑保护作用。 |
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±s表示，多个样本均数的比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法；前后时间点的比较采用配对t检验；P<0.05为差异有统计学意义。
±s)
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