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杨扬 中山大学附属第三医院 编者按：肝脏移植作为治疗终末期肝病唯一有效的方法已得到世界公认，目前肝移植术后5年生存率可达70.5%，但其应用受到供体数量的制约。据我国卫生与计划生育委员会统计，每年有150万患者等待接受肝移植手术，然而每年施行的手术量仅约1万台，供体器官数量严重缺乏的现状亟待解决。随着肝脏器官再生研究的深入及干细胞-组织工程技术的发展，干细胞为肝脏组织器官再生带来了新的曙光。本刊特邀请中山大学附属第三医院杨扬教授针对目前干细胞--组织器官的最新进展进行综述，以飨读者。 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其中多能干细胞可分化为全身各种细胞、组织，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）两大类。在体外诱导多能干细胞定向分化形成功能完善的细胞、组织、器官是其进一步临床应用的基础。目前已有大量定向分化为特定功能细胞类型的报道，包括神经、血管内皮组织、肝细胞样细胞、心肌细胞、造血细胞等，进而逐步向体外生成类器官乃至实质器官迈进。目前利用多能干细胞生产人类组织器官的主要方法有：生物材料支架构建组织工程器官、脱细胞组织/器官支架构建组织工程器官、干细胞分化成为类器官样组织、通过嵌合体生产人类组织器官。 该方法利用高分子材料预先构制铸型，为细胞生长提供附着点和微环境支持，以期维持特定的三维形态结构或发挥特定生理功能，从而形成临床可应用的人工器官。早期研究显示使用高分子可降解材料经耳形压模，制成耳廓支架，然后将牛软骨细胞接种于支架，经体外培养1~2周后植入裸鼠背部皮下可形成具有3D结构的新生耳廓组织。而将肝细胞在生物材料上形成的组织片移植到小鼠体内可发挥类似的生理功能。iPSCs的发现极大地丰富了该技术的细胞来源。生物支架具有生物相容性、可降解、基质孔径可控并促进血管生成的优点，结合自身来源的iPSCs定向分化的细胞种植，所构建的人工器官可有效避免移植排异反应的发生，具有独特的优势。 器官的脱细胞化是指在维持原器官总体形态的基础上，通过灌注洗脱器官内实质细胞而保留含有脉管结构的细胞基质骨架的过程。人工气管移植治疗终末期气管软化症作为该技术的先驱首先应用于临床。将供体气管上细胞及MHC抗原分子洗脱，接种上受体来源的上皮细胞和间充质干细胞分化而来的软骨细胞，而后移植给受者，成功避免了免疫排斥反应并获得了可喜的疗效。 在肝脏再生研究领域，研究发现利用传统的培养基培养肝细胞的过程中，肝细胞的功能及表型会快速丢失。体外培养完整肝脏器官必须解决细胞存活及代谢所必需的能量供给和物质转运问题，首先要构建细胞生长所必需的血管网及其依附的基质骨架。由于肝脏基质组分繁杂，结构精细，在体外人工直接构建肝脏基质骨架难以实现，而通过洗脱供肝实质细胞获得骨架更具可行性。Uygun等首次报道了利用脱细胞化的肝脏成功制备了可供移植的再细胞化人工器官。移植的肝细胞利用基质骨架保留了血管网结构，经体外灌注培养后植入体内，能够维持在原位并发挥功能。因此，脱细胞骨架可以诱导细胞迁徙、定位、分化，并为细胞的增殖提供必要的基础构架及营养供应。 目前研究多基于原代肝细胞及胎儿肝细胞的再细胞化，临床大规模应用受到可获取的细胞数量及伦理限制。干细胞诱导分化肝细胞已获得成功，为构建再细胞化人类完整肝脏所需的大量肝脏细胞提供了潜在的来源，特别是iPSCs诱导的具有个体特异性的肝细胞，可有效避免排斥反应，是极具潜力的供移植应用的细胞类别。 随着细胞培养技术的进步，研究发现，在3D Matrigel中培养的细胞可分化为类器官，肝脏类器官亦被成功培养，其细胞悬液经脾内注射后可于受体肝脏内增殖分化出含肝细胞及胆管细胞的团块。Takebe等诱导iPSCs直接分化为肝脏内胚层细胞（iPSC-HEs），而后与脐静脉内皮细胞（HUVECs）及间充质干细胞（MSCs）共同培养，形成肝芽，接着异位移植于免疫缺陷小鼠腹腔内，最终形成血管化的类肝器官并发挥肝脏的代谢功能。该发现开创性地在体外成功演绎了器官发生过程，为培养具有个体特异性的可供移植的肝脏带来了新的希望。由于类器官的形态及功能与机体发育正常的器官间仍有较大差距，目前仅适用于器官发生学研究、疾病模型的构建以及生理、病理和药物毒理学相关研究。 1984年，Fehilly等人构建了遗传距离更远（约4％）的山羊与绵羊的嵌合体，在毛色、体态、组织器官等方面均表现出不同程度的嵌合，同时嵌合体还可以长期存活，未发现明显异常。2008年，项鹏等报道了基于Apodemus sylvaticus/ Mus musculus两个物种（遗传上的差距是18％）建立的异种嵌合体动物模型。这些研究提示有可能建立人和猴的嵌合体，利用猴生产人类器官。近年发现的新型的基因编辑载体TALEN和CRISPR/Cas9为精准、高效的非人灵长类动物基因敲除提供了有利武器。近期，项鹏课题组利用该技术成功构建了食蟹猴MCPH1突变模型及Shank3突变的自闭症模型等灵长类动物模型。同时研究证实食蟹猴ES细胞可在猪体内发育形成猴猪嵌合体。由于正常动物体内嵌合率较低，难以形成完整器官，因此，可以考虑利用猴基因缺陷模型，抑制受体特定器官的分化、发育，使得植入的细胞形成增殖优势，实现定向的器官再生。同时使用神经特异/生殖细胞特异启动子携带自杀基因，避免伦理问题。该构想为人工器官的生产提供了新的思路。 综上所述，干细胞-组织工程技术在近年取得了长足进步，为解决器官短缺问题提供了新的思路。 （参考文献备索） 杨扬，教授、主任医师，博士研究生导师。现任中山大学附属第三医院肝脏外科主任，器官移植中心副主任。兼任中国医师协会器官移植医师分会常委、中华医学会器官移植学分会青年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会青年委员会副主任委员、中华医学会外科学分会移植学组委员、广东省医学会外科学分会首届青年委员会主任委员、广东省医学会医事法学分会副主任委员。兼任《器官移植》杂志常务编委，《中华肝脏外科手术学杂志》副总编辑及编辑部主任。2001年8月获得外科学 （器官移植学） 博士学位。2005 年在美国 Mount Sinai医学院移植中心进修。擅长肝脏、胆道、门静脉高压与胰腺外科疾病的诊断与处理，主持或参与一千三百余例临床肝移植。对肝脏外科、肝移植、移植免疫、干细胞在肝脏疾病的应用等方面有深入的研究，在肝移植术后并发症的预防和治疗方面有较为丰富的经验。 （来源：《国际肝病》编辑部） |
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