（文章篇）S6E3：lncRNA参与表观修饰

微笑如酒 2016-10-13

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国自然要开始申请了，很多朋友都想从lncRNA找出发点。今天，我们来看看，别人是怎么从大量的前期报道（recent study show）来设计课题的呢？后面怎么把一篇文章改写成国科金标书?直接点击查看

The degradation of EZH2 mediated by lncRNA ANCR attenuated the invasion and metastasis of breast cancer （Cell Death and Differentiation，19/7 2016）

下载链接：http://pan.baidu.com/s/1jIoEyQM

背景介绍：

EZH2是PRC2的催化原件，其催化活性与其余至少两个PRC2组件相关。EZH2属于组蛋白甲基转移酶，其主要功能是从辅助因子SAM转移甲基团到组蛋白27号赖氨酸（H3K27me3），最近的研究也表明，EZH2页能甲基化非组蛋白。EZH2能对H3K27进行单、双、三甲基化修饰，这产生了很多的生物学功能，包括了转录抑制与激活、造血作用、发育、细胞分化等。EZH2能阻遏基因对抑制肿瘤发生的响应作用；抑制EZH2能抑制肿瘤生长。

主要内容：

1、找到目标lncRNA分子

在该文献中，作者是直接筛选能与EZH2结合的lncRNAs。最终选择了ANCR，该分子能影响EZH2稳定性。通过RIP与RNA pulldown正反验证，lncRNA-ANCR与EZH2相互结合。

随后，对ANCR进行敲减或过表达实验，发现EZH2的蛋白水平发生了显著变化，跟ANCR表达呈负相关；而EZH2的mRNA水平并未发生明显变化。这表明，ANCR不影响EZH2转录而降低EZH2的蛋白水平。

2、机制研究

第一部分内容已经表明，ANCR影响的是EZH2转录后调控。前期我们简单介绍过，在转录后lncRNA影响蛋白水平变化，可能由于翻译受阻或是被泛素化降解。

在第二部分内容开始前，我们先了解一下蛋白酶体（Proteasome）与泛素（ubiqutin）：蛋白酶体能通过水解肽键的方式，将蛋白降解。而在此前，目标蛋白会被泛素连接上（该过程是由泛素连接酶催化），一旦该蛋白被连接上泛素，会引发连上更多的泛素，这里就形成了一个可以与蛋白酶体结合的“多泛素链”，从而将蛋白酶体带到被标记的蛋白质上，从而触发蛋白质降解。

A、在正常细胞中，使用MG132（蛋白酶体抑制剂）处理后，随着时间的推移EZH2的表达量有微量增加。（由图上看不出来，没有灰度分析。但可以这样理解：后面发现ANCR能促进EZH2泛素化降解。在正常细胞中ANCR与EZH2表达达到平衡，这是加入MG132后能抑制EZH2降解，虽然原本降解量就很少，但加入MG132还是能恢复EZH2一定的水平。）

B、过表达ANCR能显著抑制EZH2表达，但随着MG132的处理时间推进，EZH2的表达水平能显著回升。这表明EZH2的表达受到ANCR介导泛素化调控。

C、IP-wb实验表明，过表达ANCR能显著提升EZH2的泛素化降解。

D、前期报道，EZH2的泛素化以及底物泛素蛋白酶体降解作用，关键条件是CDK1介导EZH2的 345、478号苏氨酸位点磷酸化（这边就明显知道了，作者上述实验往泛素化降解这边设计的意图，原来之前就有报道EZH2泛素化降解。我们设计课题的时候也可以依葫芦画瓢）；lnc-DC能与STAT3直接结合，促进STAT3第705号酪氨酸残基磷酸化。这就推测并通过实验证实ANCR与EZH2结合能促进EZH2 第345、478号苏氨酸位点磷酸化。

E、CoIP实验验证了过表达ANCR能增加CDK1与EZH2的作用，而敲减ANCR则能削弱这种作用。

F、上述内容表明，ANCR-EZH2-CDK1可以形成三聚体。敲减ANCR能显著抑制CDK1与EZH2结合，而敲减CDK1则对ANCR、EZH2的结合作用影响不明显。这就可能意味着，ANCR与EZH2结合后能促进CDK1结合到EZH2，促进EZH2第345、478号苏氨酸位点磷酸化，从而使得EZH2通过泛素蛋白酶体途径降解。

3目标分子与临床相关性

相对于在乳腺癌中低表达，ANCR在癌旁组织表达量要高。另外在各组乳腺癌细胞株中，ANCR的表达也明显要低于上皮细胞株的表达量。

4目标分子在乳腺癌中的生物学功能

前期报道，EZH2是EMT诱导调控的关键分子，而上述实验表明ANCR能调控EZH2，那么ANCR与EMT之间应该有联系。

细胞实验：

敲减ANCR，上皮marker E-钙粘素mRNA水平下降，而间质marker N-钙粘素、波形蛋白、纤连蛋白、α-SMA的mRNA水平上升；同时，一些经典的EMT诱导蛋白Twist、Snail、ZEB1、ZEB2纷纷上调。

功能回复实验（rescue实验）：

在乳腺癌细胞（ANCR低表达）中，提升ANCR的表达，能下调一些间质marker的表达及EMT诱导蛋白，如波形蛋白、α-SAM、Snail。

这表明，抑制ANCR能诱导EMT。

EZH2是个促癌分子，能阻遏一些肿瘤抑制基因的表达。通过干扰ANCR发现，EZH2的2个靶基因 HOXA10、DAB2IP表达下降，而异位表达ANCR后，则能提升这两个基因的表达量。另外，前期报道EZH2组蛋白甲基转移酶活性与H3K27me3的存在处于正相关。干扰ANCR则能提升H3K27me3水平；此时H3K27me3富集于E-钙粘素、HOXA10、DAB2IP的启动子区（在就是为什么它们表达降低了）。