献给初学者：qPCR 常见问题及分析

teszsz 2017-01-18

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通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80～150 bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

今天给大家汇总一下 qPCR 常见问题。文章底部还有更多详细内容。

无 Ct 值出现

检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Ct 值出现过晚（Ct>38）

扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR 产物太长：一般采用 80～150 bp 的产物长度。

标准曲线线性关系不佳

加样存在误差：使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

负对照有信号

引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

扩增效率低

反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

扩增曲线异常，比如 S 型曲线

参比染料设定不正确：MasterMix 不加参比染料时，选 NONE。

模板的浓度太高或者降解。

荧光染料的降解。

定量 PCR 仪的开关机顺序是怎样的？

按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量 PCR 的收集软件，进行实验。

关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR 仪主机的电源，最后关闭电脑。

什么是 CT 值比较法？数据怎么处理？

CT 值与起始 DNA 浓度的对数成反比：

如果：不同管之间的 PCR 反应效率相同。这些 PCR 的反应效率接近 100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后 0、24、48 小时 IL-2 基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的测定结果都是 CT 值，而没有通过标准曲线测定总 RNA 的 pg 数。　　

定量 PCR 基因表达的实验数据应该如何处理？

总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。

参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的 ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映 PCR 进程。ROX 校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同时定量一个内对照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。
计算相对于基准样品（Calibrator）的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0 小时和 6 小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6 小时/0 小时、患病/正常。

怎样判断定量 pcr 仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？

一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。

另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行 ROI 的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。

清除样本加热块污染的步骤如下：