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万事屋以前发过一个帖子，是一个在线构建质粒的软件，有时候打不开，打开了还要注册。Clone manager是一个PC端软件，很好用。 下面就以pUC19上插入一段基因为例，为大家介绍clone manager的用法（图片上的数字对应文字介绍的步骤）。 首先下载好pUC19(AccessionNo：L09137)和需要插入的基因（土曲霉cre基因为例，locus tag：ATEG_01118），选择pUC19基因序列后右键复制。 1、 在clonemanager界面点击File→New，选择Paste sequence→下一步→完成。 2、 左边选择Circularmolecule（该选项为环形质粒，另一个为线性核酸），右边选择Do not Auto Scan（如图）→OK 3、 点击放大镜，新出现的页面左边部分点击List of Enzymes，选择Single cutters→OK→Add Sites→是。于是整个质粒的酶切位点就全部显示出来了，那里有一大串酶切位点的地方就是多克隆位点了。
现在导入cre基因序列，方法和导入pUC19的序列一样，只是在上面第2步的时候要选择Linearmolecule。 4、 此时出现cre序列的对话框，sequence→点击铅笔图标（如图）。 5、 在序列的最前端加入EcoRI的识别序列，序列最后面加入Kpn I的识别序列（当然你可以根据自己的需要添加不同的酶切位点），添加完之后记得一定要打绿色的钩。
至此，准备工作已完成，下面就是剪切和连接了。 6、点击放大镜右边的剪刀工具
同样的方法，选择pUC19的对话框，用EcoR I和Kpn I进行双酶切。记得选择最长的链，也就是你需要连接的载体。 7、左上角输入Pst I，右边的界面会出现该酶切位点的信息，双击选择。Pst I后面加上英文的逗号后输入Kpn I，同样在右边双击选择→OK→fragments选择中间的→Use Now→OK。 8、选择剪刀工具右边的连接工具 9、点击右边的双螺旋图标，在新出来的对话框中选择已经剪切好的cre序列→select→Ligate→OK 至此在载体上插入序列的工作已完成。如果以上操作过程都能够顺利进行，那么排除酶切不成功的问题，载体连接都可以顺利进行。另外clone manager可以标记质粒上的序列，在对话框下方的Features中可以找到，大家稍加摸索就能找到。另外用虚拟打印机可以输出质粒的图片，在Features中对基因做的标记打印出来的和软件上看的不同，大家试一试就知道了。 …华丽丽的分割线… |
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