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2017-02-28 miRNA是一类内源性非编码单链RNA，在体内以前体和成熟体的形式存在，而我们对某种的microRNA的表达检测的对象是成熟体，microRNA的成熟体长度约为19-25nt，由于其序列和性质的特殊性，我们需要使用与普通mRNA不同的方法对其进行引物的设计。目前主流的方法有两种：茎环法和加尾法。 基本的原理图示如上，因为microRNA很短，引物为了方便接下来的检测我们可以通过具有颈环样结构的反转引物先将microRNA进行逆转录，然后再将用于表达检测的3‘引物（即图中reverse）设计在反转引物上，最后结合mircoRNA的5‘序列设计一个5’端的定量PCR引物（图中Forward）即可。小结一下就是我们需要设计3条引物，一条做反转录的颈环引物，和2条用于做表达检测引物（Forward和reverse引物）。 茎环结构不但能有效地延长 miRNA 的长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。整个引物由 2 部分组成，一个通用的茎环结构和5 ～ 8 个与目的 miRNA 的 3'端反向互补的碱基。其序列通常为: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'。其中下划线部分为茎环自身互补部分。我们可以看看这个通用的茎环结构序列怎样互补成颈环的。 用DNAstar中的primer select 点击report中的primer hairpins 报告第一个就是我们通用的一个典型茎环结构了，接下来只需要根据我们的目标microRNA的序列在此序列后加入5-8个碱基与目的 MicroRNA 的 3'端反向互补即可。 举个例子：hsa-miR-26a (注意大小写) 首先需通过英国著名miRNA数据库网站miRBase （http://www./）检索成熟miRNA序列。在miRBase上可获得目前已经公布的各个物种的microRNA具体序列、基因分布、详细序列注册信息，可以通过浏览或搜索的方式查询目的miRNA。 输入hsa-mir-26a ，点击go 可以看见有3中成熟体，选着你想检测的一种，比如：hsa-miR-26a-5p，Get到 sequence，如下 >hsa-miR-26a-5p MIMAT0000082 UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 将U全部改成T TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT 把后面的6个碱基反向互补后加到上述颈环序列3‘端，即为： 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCTA-3' 这样我们的RT引物就大概可以了。 继续.................................... 表达检测用3‘端引物设计（这个最简单！） 该引物为通用引物，能和颈环序列的一部分结合。 5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3' 可以通用 用primer select查看一下Tm 最后据此设计上游5’端检测引物，上游引物较特殊，是由 5'端碱基( 模板外) 与 miRNA 特异序列( 模板内) 2 部分组成的。设计上游引物物时，必须注意的是，反转录后的扩增反应体系中存在着大量剩余的反转录引物，所以在上游引物设计的时候不能与反转录引物有重叠，否则会得到反转录引物和上游引物的二聚体。在我们的例子中，不与反转录引物重叠的部分的碱基剩16个，若想使引物长度不变，只能使得上游引物延伸到模板链外侧。上游引物 5'端的添加碱基要与目的 miRNA 相适应，不同的 miRNA 序列之间差异很大，5'端添加的这些碱基不可能适用于所有 miRNA，也就是说它并不具有通用性。所以只能根据具体的实验做好调整。 这个例子中我们剩下的16个碱基序列分析一下Tm：TTCAAGTAATCCAGGA， 按照primer select的算法才33度 和通用的3‘引物差了16度 ，所以需要在其5’端加入几个碱基以增加引物的Tm，5‘端添加碱基后：CGTCCTTCAAGTAATCCAGGA 序列Tm为51度，基本接近了3‘通用引物了。 primer select计算一下
最后我们还需要对这个5’引物的特异性进行检测 进入miRbase
点击search后输入我们设计的5’端引物进行blast分析即可。经过验证，针对hsa-miR-26a-5p的检测引物和反转引物都ok了，把序列发给合成公司，准备开工吧！
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