一篇文章学会ChIP-seq分析(上)原创 2017-05-10 jimmy 生信技能树
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biotrainee 生物信息学学习资料分析,常见数据格式及公共数据库资料分享。常见分析软件及流程,基因检测及癌症相关动态。 写在前面:《一篇文章学会ChIP-seq分析(上)》《一篇文章学会ChIP-seq分析(下)》为生信菜鸟团博客相关文章合集,共九讲内容。带领你从相关文献解读、资料收集和公共数据下载开始,通过软件安装、数据比对、寻找并注释peak、寻找motif等ChIP-seq分析主要步骤入手学习,最后还会介绍相关可视化工具。第一讲:文献选择与解读文献;CARM1 Methylates Chromatin Remodeling Factor BAF155 to Enhance Tumor Progression and Metastasis 我很早以前想自学CHIP-seq的时候关注过这篇文章,那时候懂得还不多,甚至都没有仔细看这篇文章就随便下载了数据进行分析,也只是跑一些软件而已。这次仔细阅读这篇文章才发现里面门道很多,尤其是ChIP-seq的实验基础和表观遗传学的生物学基础知识。 作者首先实验证明了用small haripin RNA来knockout CARM1 只能达到90%的敲除效果,有趣的是,对CARM1的功能影响非常小,说明只需要极少量的CARM1就可以发挥很好的作用,因此作者通过zinc finger nuclease这种基因组编辑技术设计了100%敲除CARM1的实验材料。(当然,现在有更好的基因编辑技术啦) 这样就能比较CARM1有无时各种蛋白被催化状态了,其中SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色质重构复合物的一个亚基 BAF155,非常明显的只有在CARM1这个基因完好无损的细胞系里面才能被正常的甲基化。作者证明了BAF155是CARM1这个基因非常好的一个底物, 而且通过巧妙的实验设计,证明了BAF155这个蛋白的第1064位氨基酸(R) 是 CARM1的作用位点。 因为早就有各种文献说明了SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色质重构复合物在癌症的重要作用, 所以作者也很自然想探究BAF155在癌症的功能详情,这里作者选择的是ChIP-seq技术。BAF155是作为SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色质重构复合物的一个组分,必然neng 直接或者间接的结合DNA咯。而ChIP-seq技术最适合来探究能直接或者间接结合DNA的蛋白的功能,所以作者构造了一种细胞系(MCF7),它的BAF155蛋白的第1064位氨基酸(R) 突变而无法被CARM1这个基因催化而甲基化,然后比较突变的细胞系和野生型细胞系的BAF155的两个ChIP-seq结果,这样就可以研究BAF155是否必须要被CARM1这个基因催化而甲基化后才能行使生物学功能。 作者用me-BAF155特异性抗体+western bloting 证明了正常的野生型MCF7细胞系里面有~74%的BAF155被甲基化。 有一个细胞系SKOV3,可以正常表达除了BAF155之外的其余14种SWI/SNF(BAF) chromatin remodeling complex 染色质重构复合物,而不管是把突变的细胞系和野生型细胞系的BAF155混在里面都可以促进染色质重构复合物的组装,所以甲基化与否并不影响这个染色质重构复合物的组装,重点应该研究的是甲基化会影响BAF155在基因组其它地方结合。 结果显示,突变的细胞系和野生型细胞系种BAF155在基因组结合位置(peaks)还是有较大的overlap的,重点是看它们的peaks在各种基因组区域(基因上下游,5,3端UTR,启动子,内含子,外显子,基因间区域,microRNA区域)分布情况的差别,还有它们距离转录起始位点的距离的分布区别,还有它们注释到的基因区别,已经基因富集到什么通路等等。 虽然作者在人的细胞系(MCF7)上面做ChIP-seq,但是在老鼠细胞系(MDA-MB-231)做了mRNA芯片数据分析,BAF155这个蛋白的第1064位氨基酸(R) 突变细胞系和野生型细胞系,用的是Affymetrix HG U133 Plus 2.0这个常用平台。 which was hybridized to Affymetrix HG U133 Plus 2.0 microarrays containing 54,675 probesets for >47,000 transcripts and variants, including 38,500 human genes. To identify genes differentially expressed between MDA-MB-231-BAF155WT and MDA-MB-231-BAF155R1064K 表达矩阵下载地址:http://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC4004525/bin/NIHMS556863-supplement-03.xlsx 我简单摘抄作者ChIP-seq数据的生物信息学分析结果
用到的软件有
以上就是我们接下来需要学习的流程化分析步骤,下面我给一个主要流程的截图,但主要是实验是如何设计 这里有一个文章发表了关于CHIP-seq的流程的:http://biow./ecolebioinfo/protected/jacques.van-helden/ThomasChollierNatProtoc2012peak-motifs.pdf 同时我还推荐大家看几篇相关文献
第二讲:资料收集CHIP-seq的确是非常完善的NGS流程,各种资料层出不穷。 大家首先可以看下面几个完整流程的PPT来对CHIP-seq流程有个大致的印象,我对前面提到的文献数据处理的几个要点,就跟下面这个图片类似。
然后下面的各种资料,是针对CHIP-seq流程的各个环境的,还有一些是针对于表观遗传学知识
可视化工具 bioconductor系列工具和教程 :
公司教程 第三讲:公共数据下载这一步跟自学其它高通量测序数据处理一样,就是仔细研读paper,在里面找到作者把原始测序数据放在了哪个公共数据库里面,一般是NCBI的GEO,SRA,本文也不例外,然后解析样本数,找到下载链接规律。
很容易就下载了8个测序文件,每个样本的数据大小,测序量如下
虽然下载的SRA格式数据也是一个很流行的标准,但它只是数据压缩的标准,几乎没有软件能直接跟SRA的格式的测序数据来进行分析,我们需要转成fastq格式,代码如下:
解压的详情如下,可以看到SRA格式有6~9倍的压缩了,比zip格式压缩的2~3倍高多了
第四讲:必要软件安装及结果下载博文的顺序有点乱,因为怕读到前面的公共测序数据下载这篇文章的朋友搞不清楚,我如何调用各种软件的,所以我这里强势插入一篇博客来描述这件事,当然也只是略过,我所有的软件理论上都是安装在我的home目录下的biosoft文件夹,所以你看到我一般安装程序都是:
这只是我个人的安装习惯,因为我不是root,所以不能在linux系统下做太多事,我这里贴出我所有的软件安装代码:
一般来说,对我这样水平的人来说,软件安装就跟家常便饭一样,没有什么问题了,但如果你是初学者呢,肯定没那么轻松,所以请加强学习,我无法在这里讲解太具体的知识了。 所有软件安装完毕后就可以下载文章对这些ChIP-seq的处理结果了,这个很重要,检验我们是否重复了人家的数据分析过程。
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