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两种检测抗双链DNA抗体方法的比较
安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 临床医学研究
作者：汪国生　张宏　吴向辉　李向培
单位：安徽省立医院风湿科，合肥　230001
关键词：DNA；抗体；分析；胶体金；免疫印迹法
　　摘要　目的　比较斑点免疫金胶体渗滤法（DIGFA）和间接免疫荧光法（IIF）检测抗ds-DNA抗体。 方法　采集内科门诊和住院患者血标本2 100份，其中同期住院的系统性红斑狼疮（SLE）118例155份标本、类风湿关节炎（RA）44例44份标本。同时检测ANA（IIF法）、抗ds-DNA抗体（IIF法和DIGFA法）。结果　2 100份标本、住院SLE和RA患者DIGFA法检测抗ds-DNA抗体的检出率均显著高于IIF法，分别为9.86%对4.71%、54.24%对35.59%和2.27%对0%。两种方法的符合率分别为94.95%、77.97%和97.73%。以IIF为金标准，DIGFA检测抗ds-DNA抗体的敏感性和特异性分别为91.92%和94.20%。在2 100份检测及住院SLE患者分别有16.36%和25.92%在IIF法抗体转阴时，DIGFA法抗ds-DNA抗体仍呈阳性。结论　DIGFA法检测抗ds-DNA抗体简便、快速、结果直观，检出率高于IIF法，有助于SLE的回顾性诊断，可以替代IIF法或对IIF法补充。
[-hzh-] 　　中图分类号　R446.62 ；R392.11　　文献标识码　A
　　文章编号　1000-1492(2000)05-0357-03
　　抗双链DNA（ds-DNA）抗体是系统性红斑狼疮（systyemic lupus erythematosus, SLE）比较特异的抗体，是SLE的诊断标准之一，与SLE的肾损害相关，是评价SLE疾病活动指标之一。经典的检测方法是以马疫锥虫或短膜虫为底物的间接免疫荧光法(indirect immune fluorescent ,IIF)，但阳性率仅30%～40%，且需要荧光显微镜，基层单位难以开展。放射免疫法虽较IIF法敏感，但同样需要一定的检测仪器。两种检测方法都费时费力，需要一定的检验技术。我科自1996年6月～1998年6月同时开展了斑点免疫金胶体渗滤试验（dot immuno-gold filtration assay, DIGFA）和IIF法检测抗ds-DNA抗体。现将两种检测方法结果比较如下。
　　1　材料与方法
　　1.1　一般情况　送检血清来自本院内科门诊及住院患者，计2 100份，男性424份，女性1 676份，年龄9～72岁，平均39.6岁±20.6岁。其中包括同期住院的SLE患者118例155份标本，类风湿性关节炎(RA)患者44例44份标本。SLE的诊断符合1982年美国风湿病学会的诊断标准^〔1〕，狼疮活动的判断依据系统性红斑狼疮疾病活动指标（SLEDAI）^〔2〕。RA诊断符合美国风湿病学会1987年诊断标准^〔3〕。所有血清均同时检测了抗核抗体（ANA）、抗ds-DNA抗体。
　　1.2　检测方法
　　1.2.1　抗核抗体　IIF法，以HEP-2细胞为底物，抗原片购自北京协和医院检验科荧光室，具体检测步骤如下：抗原片从冰箱中取出立即风干，滴加1∶5稀释的标本，放湿盒中置37℃温箱内30 min，0.01 mol·L^-1 pH7.2 PBS泡洗3次，每次5 min，滴加荧光素标记的抗人IgG，放湿盒中置37℃温箱内30 min，PBS泡洗3次同上，缓冲甘油封片，荧光显微镜镜检，阳性血清进一步测定抗体滴度。
　　1.2.2　抗ds-DNA抗体的检测　IIF法和DIGFA两种方法同时开展。IIF法以马疫锥虫为底物，具体操作方法参见抗核抗体检测。DIGFA试剂盒购自广州万孚生物技术有限公司。具体操作方法如下：取100 μl 待检血清于测定板上过滤器小孔内，待血清完全渗滤后除去过滤器，加金标液4滴于测定板小孔中待渗干，加洗板液1滴于测定板小孔中待渗干，即可观察结果。结果判断：测定板小孔中央的膜上出现红色的“○”为阳性，出现红色的“-”为阴性，无任何显示为试剂失效。
　　1.3　统计方法　分别计算抗ds-DNA抗体两种检测方法对SLE和RA患者的阳性率、符合率。以IIF法为检测抗ds-DNA抗体的金标准，计算DIGFA检测抗ds-DNA抗体的敏感性和特异性。计数资料的比较行χ²检验或Fisher***检验。
　　2　结果
　　2.1　抗ds-DNA抗体两种检测方法结果　2 100份标本检测三项中任一项阳性者458份，全部阴性者1 642份。抗ds-DNA抗体的两种检测方法有124份不符合，符合率为94.95%（1 976/2 100），其中DIGFA法有207份阳性，阳性率9.86%，IIF法有99份阳性，阳性率4.71%，两者相比差异有显著性（χ²=40.36，P＜0.01），DIGFA对抗ds-DNA抗体的检出率明显高于IIF法。IIF法抗ds-DNA抗体阳性者ANA全部阳性，与ANA符合率为100%；DIGFA检测阳性者中，ANA阳性195份，与ANA的符合率为94.20%。
　　2.2　DIGFA法的敏感性和特异性　如以IIF法为检测抗ds-DNA抗体的金标准，2 100份标本检测DIGFA法检测抗ds-DNA抗体的敏感性为91.92%（91/99），特异性为94.20%（1 885/2 001），假阳性率为5.80%（116/2 001），假阴性率为8.08%（8/99）。
　　2.3　SLE患者检测结果　118例SLE共进行155次抗核抗体和抗ds-DNA抗体的检测，全部病例抗核抗体阳性。抗ds-DNA抗体IIF法检测42例阳性，阳性率为35.59%（42/118），而DIGFA法检测有64例阳性，阳性率为54.24%（64/118），DIGFA法阳性率较IIF法高（χ²=7.55，P＜0.01）。两种方法符合率为77.97%。在27例重复检测的患者中，有7例（25.92%）观察到抗ds-DNA抗体IIF法已经转阴，而DIGFA法仍呈阳性。
　　2.4　SLE活动期和缓解期比较　118例SLE患者狼疮活动期82例，缓解期36例，两种方法检测活动期与缓解期抗ds-DNA抗体的阳性率分别为DIGFA法68.29%（56/82）对22.22%（8/36），IIF法48.78%（40/82）对5.56%（2/36）。两种方法检测抗ds-DNA抗体都是狼疮活动期阳性率高，DIGFA法检测抗ds-DNA抗体的阳性率在活动期和缓解期均显著高于IIF法（活动期χ²=5.65，P＜0.05；缓解期Fisher***检验P＜0.05）。
　　2.5　RA患者检测结果　44例RA患者ANA的阳性率为6.82%（3/44），DIGFA法抗ds-DNA抗体的检出率为2.27%（1/44），IIF法未检出阳性病例，抗ds-DNA抗体两种检测方法的符合率为97.73%。
　　3　讨论
　　抗ds-DNA抗体是SLE重要的自身抗体之一，具有致病性，有效的治疗可使其滴度下降或转阴，是观察治疗效果的***抗体。国内目前多采用IIF法和放射免疫法检测，因操作过程复杂、人为影响因素多、需要特殊仪器，限制了在基层单位的开展。DIGFA化繁为简采用高度灵敏的亲和素-生物素系统将ds-DNA包被在硝基纤维素薄膜上，结合了胶体金标记和斑点渗滤技术，检测血清中抗ds-DNA抗体，3 min内即可观察结果。具有简便、快速、结果直观、不需特殊设备的特点。但由于DIGFA用于抗ds-DNA抗体的检测时间短，其敏感性和特异性如何，让人心存疑虑。国内兰小鹏等^〔4〕报道DIGFA对未经筛选的SLE患者抗ds-DNA抗体的阳性率为65.6%，其中活动期和缓解期的SLE的阳性率分别为96.1%和10.4%，DIGFA的阳性率与放射免疫法相似，高于酶联免疫吸附试验和IIF法，而假阳性率明显低于放射免疫法和酶联免疫吸附试验。我们的结果与之相符，但在SLE活动期DIGFA法抗ds-DNA 抗体的阳性率仅为68.29%。侯丽燕等^〔5〕报道27名正常儿童和17例非狼疮患者两种方法检测抗ds-DNA抗体皆阴性，29例SLE患者DIGFA和IIF法检测抗ds-DNA抗体阳性率分别为62.07%和58.62%，阳性符合率为94.44%，并且两种检测方法滴度一致。我们2年中2 100份标本检测显示：2 100份标本及其中的SLE和RA住院患者，DIGFA对抗ds-DNA抗体的检出率均高于IIF法，两种方法的符合率分别达94.95%、77.97%和97.73%。在2 100份检测中，如以IIF法为检测抗ds-DNA抗体的金标准，DIGFA检测抗ds-DNA抗体的敏感性和特异性分别达91.92%和94.20%。SLE患者两种方法符合率较低，主要是因为DIGFA对抗ds-DNA抗体检出率提高。我们观察到两种方法滴度并非完全一致，在2 100份检测和SLE患者中分别有16.36%和25.92%在IIF法抗ds-DNA抗体转阴后，DIGFA法仍阳性。提示DIGFA检测抗ds-DNA抗体更灵敏，对缓解或稳定的SLE患者的回顾性诊断有帮助。116份DIGFA阳性而IIF法阴性中只有9人12份标本ANA始终阴性，是否是DIGFA假阳性，正在追踪观察。
　　DIGFA是检测抗ds-DNA抗体简便、可靠的方法，可作为对IIF法的替代和补充应用于临床。
Comparation of dot immunogold label filtration assay and indirect
　　immune fluorescent assay in the detection of anti-dsDNA antibody
Wang Guosheng, Zhang Hong, Wu Xianghui et al
　　(Dept Of Rheumatology, Anhui Provincial Hospital, Hefei　230001)
　　Abstract　Objective　To compare the effects of dot immunogold label filtration assay(DIGFA) and indirect immune fluorescent assay(IIF) in detecting the anti-dsDNA antibody. Methods　Serum samples of 2 100 from outpatients and inpatients including 155 samples from 118 SLE inpatients and 44 samples from 44 RA inpatients were tested for ANA with IIF and anti-dsDNA antibody with IIF and DIGFA. Results The positive rates of anti-dsDNA antibody with DIGFA and IIF in 2 100 samples, SLE and RA inpatients were 9.86% vs 4.71%, 54.24% vs 35.59% and 2.27% vs 0% respectively. The positive rates of anti-dsDNA antibody with DIGFA in 3 groups were higher than those with IIF. The coincidence of two methods in 2 100 samples, SLE and RA inpatients was 94.95%, 77.97% and 97.73% respectively. Compared to IIF, the sensitivity and specificity of DIGFA were 91.92% and 94.20% in 2 100 samples. Anti-dsDNA antibody with DIGFA was still positive in 16.36% of 2 100 samples and 25.92% SLE inpatients when it became to the negative with IIF. Conclusion DIGFA used in the detection of anti-dsDNA antibody is faster and more sensitive than IIF and it dose not require any large equipment. The positive of anti-dsDNA antibody using DIGFA will contribute to the retrospective diagnosis of SLE. IIF can be replaced and supplemented by DIGFA.
　　MeSH　DNA； antibodies/analysis；gold colloid；immunoblotting
　　作者简介：汪国生，男，35岁，主治医师；李向培，女，44岁，主任医师,安徽省风湿病学会主任委员
参考文献
　　1，Tan EM, Cohen AS, Fries JF et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus(SLE). Arthritis Rheum ，1982;25（11）:1 271～1 277
　　2，Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB et al. Derivation of the SLEDAI: a disease activity index for lupus patients. Arthritis Rheum，1992;35（6）:630～640
　　3，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum，1988;31（3）:315～324
　　4，兰小鹏，黄俏佳，涂向东 等. 快速斑点免疫金渗滤法检测抗双链DNA抗体. 中华皮肤科杂志，1997;30（1）:49～50
　　5侯丽燕，陈　燕，何晓琥 等. 抗dsDNA抗体两种检测方法的比较. 风湿病学杂志，1997;2（4）:30～32
2000-02-24收稿
　　2000-06-16修回