Src激酶在骨肉瘤U2OS细胞失巢凋亡中的作用*

·论著·

Src激酶在骨肉瘤U2OS细胞失巢凋亡中的作用*

吕杨帆 高自然 郭乔楠 彭动斌 亢夏

(第三军医大学第二附属医院病理科， 重庆 400037)

【摘要】目的 探讨Src激酶在骨肉瘤U2OS细胞失巢凋亡中的作用。方法 采用超低黏附板构建骨肉瘤U2OS细胞失巢凋亡抵抗模型，Western blot检测骨肉瘤U2OS细胞和失巢凋亡抵抗细胞中Src激酶蛋白的水平。加入Src激酶抑制剂，Western blot检测U2OS细胞中Src激酶蛋白的水平变化，并利用TUNEL染色和流式细胞双染技术检测细胞凋亡率。结果 成功构建骨肉瘤失巢凋亡抵抗模型细胞(U2OSar)，在骨肉瘤失巢凋亡过程中，p-Src的蛋白水平逐渐升高；与骨肉瘤U2OS细胞相比，U2OSar细胞中，p-Src/Src蛋白灰度比值0.23上升至0.91(P<0.05)；加入src激酶抑制剂pp2后，>P<0.05)。结论>

【关键词】骨肉瘤； Src激酶； 失巢凋亡

骨肉瘤是青少年最常见的骨原发恶性肿瘤之一，高发的肺转移率是影响其疗效和临床预后的重要因素，而骨肉瘤的失巢凋亡抵抗是其发生远处转移的关键步骤。因此，有关骨肉瘤失巢凋亡抵抗的研究为当前的研究热点。文献报道Src激酶参与调控了多种肿瘤的发生发展，与其恶性表型相关。作为非受体酪氨酸激酶，Src激酶介导黏附因子 、趋化因子、生长因子等信号通路[1]，在多种肿瘤中发挥原癌基因的作用。但目前国内尚未有文献报道Src激酶与骨肉瘤失巢凋亡的关系，本研究拟采用骨肉瘤失巢凋亡抵抗模型，研究Src激酶在骨肉瘤失巢凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 人骨肉瘤细胞株U2OS购自美国菌种保藏中心，DMEM培养基购自美国Hycolone公司，胰酶购自美国Sigma公司，超低黏附板购自美国康宁公司，蛋白裂解液购自美国Pierce公司，电泳液、电转液的粉剂均购自生工公司，蛋白酶抑制剂、蛋白Marker及BCA试剂盒均购自美国Thermo公司，蛋白上样缓冲液购自江苏碧云天公司，GAPDH、Src、p-Src一抗购自细胞信号公司，TUNEL染色试剂盒购于美国Roche公司，4%多聚甲醛及Triton X- 100购自江苏碧云天生物公司，山羊非免疫血清购自武汉博士的生物公司，Src激酶抑制剂PP2购自Selleck公司，Annexin V-FITC和PI购自美国Roche公司。电泳仪、电泳槽、半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，流式细胞仪为德国Beckman公司的Gallios。

1.2 方法

1.2.1 骨肉瘤U2OS细胞失巢凋亡抵抗模型的建立 将细胞融合度达80%～90%骨肉瘤U2OS细胞用0.25%胰酶常规消化、离心后，转至超低粘附 6孔板中，利用超低黏附板模拟细胞在体内的失巢环境，每孔约6×105个细胞，细胞呈悬浮培养，隔日换液，换液时操作轻柔，避免触碰超低黏附板底部，避免破坏细胞团块状态[3-4]。在悬浮培3天后，将细胞收集、离心，接种于普通的培养瓶中，待细胞长至单层后再悬浮培养14天，再次贴壁培养所得的细胞，即为失巢凋亡抵抗细胞，记为U2OSar。

1.2.2 Western blot检测U2OS细胞和U2OSar细胞Src及p-Src蛋白水平 采用Pierce公司蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，按照参考文献方法进行电泳、电转、封闭和抗体孵育[2]。利用Pierce公司显影剂、Bio-RAD公司凝胶成像仪显影，以GAPDH为内参，Image Lab图像分析软件分析相关蛋白表达情况。

1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡 加入Src激酶抑制剂PP2前后，采用TUNEL检测U2OS细胞凋亡。循TUNEL染色试剂盒说明书：利用 4%多聚甲醛制备细胞爬片，山羊非免疫血清封闭、0.3%Triton X- 100通透、滴加TUNEL反应液，抗荧光淬灭甘油封片剂进行封片，Zeiss激光共聚焦显微镜下采集图像。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 流式双标法检测凋亡率 将U2OS细胞置于超低黏附板，悬浮培养3天，实验组加入终浓度为50 nmol/L的PP2，离心收集细胞，加入3 μl Annexin V-FITC 避光孵育15 min后，加入3 μl PI，孵育8 min后，转移至流式管，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。获取四个象限的细胞直方图，以右上象限(晚期凋亡细胞)和右下象限(早期凋亡细胞)细胞比例相加，记为细胞的凋亡率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差±s)表示，组间均数比较采用独立样本t检验，P<>

2 结果

2.1 U2OS和U2OSar细胞形态 倒置显微镜观察，U2OS细胞呈短梭形或多角形，折光性良好；U2OSar细胞形态与U2OS相比，呈长梭形，折光性更强(图1)。

图1 U2OS和U2OSar细胞形态(×100)

Figure 1 Morphology of U2OS2 and anoikis resistance U2OSar viewed under the light microscope

注：A.U2OS细胞，B.U2OSar细胞。

2.2 U2OS细胞及U2OSar细胞p-Src及Src蛋白水平比较 U2OSar中p-Src蛋白水平高于U2OS细胞(P<>

图2 U2OS细胞及U2OSar细胞p-Src及Src蛋白水平

Figure 2 Western blot analysis of Src and p-Src

2.3 加入Src激酶抑制剂前后，骨肉瘤U2OS细胞Src及p-Src蛋白水平比较 加入Src激酶抑制剂PP2后，检测Src及p-Src蛋白表达结果示：p-Src蛋白水平较未加入抑制剂组显著下调(P<>

图3 加入Src抑制剂PP2，Src及p-Src蛋白水平

Figure 3 Western blot analysis of Src and p-Src in cells treated with or without PP2

2.4 加入Src激酶抑制剂前后，骨肉瘤U2OS细胞凋亡率比较 加入Src激酶抑制剂PP2后， AnnexinV/PI染色，细胞凋亡率从46.66%降至28.32%，差异具有统计学意义(P<>

图4 加入Src抑制剂前后，骨肉瘤细胞的凋亡

Figure 4 The effect of Src inhibitor on osteosarcoma cells′ apoptosis

注：A-C. Src抑制剂PP2加入前后，流式检测骨肉瘤细胞U2OS凋亡率；D. Src抑制剂PP2加入前后，骨肉瘤细胞U2OS的TUNEL染色情况。

3 讨论

骨肉瘤是好发于青少年的骨原发恶性肿瘤，发病部位多位于长骨干骺端，恶性程度高，极易复发并发生远处转移。近年采用保肢及新辅助化疗，骨肉瘤患者的临床预后有所改善，但20年来生存率似乎处于停滞状态[5]。因此，探讨骨肉瘤发生及侵袭和转移的机制仍然是目前研究的热点和难点问题。肿瘤转移是癌细胞从肿瘤原发部位脱离，最终定植于远处器官即发生转移，该过程是通过一系列时序性的步骤来实现的[6]。近期肿瘤微环境学说亦引起了广泛关注，即肿瘤细胞预先在转移的靶器官形成适合种植生长的微环境[7]。以上步骤均为肿瘤发生远处转移所必需，其中肿瘤细胞脱离原发部位后所产生的“非锚着依赖生长”的能力参与了上述转移级联的多个步骤，是肿瘤细胞实现转移的基础和关键所在，即失巢凋亡抵抗是肿瘤发生远处转移首要且关键的步骤[8]。因此，在失巢凋亡中发生重要作用的分子可能为骨肉瘤的临床治疗提供新的思路和策略[9]。

Src家族(Src family kinases, SFKs)包括c-Src、Blk、Fgr、Fyn、Frk、Hck、Lck、Lyn、Yes、Yrk等，均作为原癌基因发挥作用[10-11]。SFKs作为非受体蛋白酪氨酸激酶，可以激活下游的受体、整合蛋白等，进而在肿瘤的增殖和远处转移中发挥重要作用。其中c-Src被研究的最为广泛，可以与相应的跨膜受体紧密结合，例如表皮生长因子、血小板衍生生长因子受体、血管内皮生长因子受体，进而激活一系列下游的通路发生相应的效应。Src基因是第一个被发现的人类内在的具有酪氨酸激酶活性的基因[12]。Src蛋白几乎表达于所有真核细胞，是参与胞内信号转到的重要分子，介导粘附因子、趋化因子和生长因子多条通路，在细胞增殖、生长、分化、运动和凋亡调控过程中均发挥非常重要的作用。Src激酶与乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[13-16]，同时Src激酶与骨肉瘤的增殖亦相关[17]。其分子机制包括：Src激酶可激活相关通路，进而促进肿瘤细胞肌动蛋白骨架重组、诱导血管生成、促进肿瘤上皮间叶转化等[18-19]。

肿瘤细胞能在脱离肿瘤自身的微环境以及细胞外基质的情况下发生失巢凋亡抵抗，进而生存、增殖。肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗现已成为其转移的一个标记，而不同类型的肿瘤其锚定非依赖性生长具有异质性。目前，肿瘤细胞失巢凋亡抵抗的机制还未完全阐明，较公认的分子机制包括生存转导途径的激活和凋亡信号途径的抑制两大方面[20]。而肿瘤细胞失巢凋亡抵抗的形成主要包含以下五方面因素：生存转导信号途径持续激活、整合素表达形式的改变、持续的氧化应激、EMT以及缺氧[21-23]。

本研究中，我们从失巢凋亡的角度探讨Src激酶在骨肉瘤发生发展中的作用，发现Src激酶在骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞中是持续活化的，进一步验证了其在骨肉瘤中的促癌作用。在进一步研究中，我们利用Src激酶抑制剂抑制其活性后，发现骨肉瘤细胞的凋亡率显著提高，说明了Src激酶可能是通过抑制骨肉瘤细胞的失巢凋亡进而促进骨肉瘤的发展。我们从体外实验探讨Src激酶对骨肉瘤失巢凋亡的作用，但并未在体内实验进行验证。失巢凋亡抵抗是肿瘤发生远处转移的首要步骤，Src激酶可能对骨肉瘤的远处转移起到一定的作用。

Src激酶通过促进骨肉瘤细胞的失巢凋亡抵抗发挥其促癌作用，而失巢凋亡抵抗与骨肉瘤的远处转移密切相关。Src激酶抑制剂PP2可以显著促进肿瘤细胞的凋亡，其是否在体内亦可促进肿瘤的凋亡进而发挥抑癌作用值得深入研究。因此，进一步探讨Src激酶与骨肉瘤失巢凋亡抵抗的关系及其相应的分子机制，有可能为骨肉瘤的治疗提供新的思路。

4 结论

我们成功建立了骨肉瘤失巢凋亡抵抗模型；在骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞中， Src激酶活化程度增高，即Src激酶的活化促进了骨肉瘤细胞的失巢凋亡抵抗，可能通过表达活化参与骨肉瘤的失巢凋亡抵抗，进而促进了骨肉瘤的演进。Src激酶抑制剂PP2可显著抑制骨肉瘤细胞U2OS中Src激酶的活性，且明显增加肿瘤细胞的凋亡。靶向抑制Src激酶可能作为一个抑制骨肉瘤失巢凋亡抵抗的新的治疗方向，为研究骨肉瘤发生发展的机制提供新的方向和思路。

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Effects of Src on anoikis in osteodarcoma

LV Yangfan,GAO Ziran,GUO Qiaonan,PENG Dongbin,KANG Xia

(Department of Pathology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)

【Abstract】Objective To observe the role and effect of Src on anoikis in osteosarcoma. Methods Ultralow attachment 6 well plates were applied to establish the anoikis resistance model of osteosarcoma.Western blot assays were used to detect the expression of total Src and phosphorylated Src. After treated with Src inhibitor, the levels of Src and phosphorylated Src were tested, and the apoptosis rate was examined by using TUNEL assays and flow cytometry. Results The anoikis resistance model of osteosarcoma was successfully established. The phosphorylated Src′s gradual upregulation was accompanied with gradual enhanced anoikis resistance. The expression of phosphorylated Src in anoikis resistance osteosarcoma cells was higher than that of wide type (P<0.05). after="" treated="" with="" src="" inhibitor="" (pp2),="" phosphorylated="" src,="" the="" active="" form="" of="" src,="" was="" significantly="" repressed,="" while="" the="" apoptosis="" was="" clearly="" restrained="">P<0.05). conclusion="" src="" regulates="" anoikis="" in="" osteosarcoma="" can="" inhibite="" tumor="" cell="" apoptosis="" and="" contribute="" to="" its="" anoikis="">

【Key words】Osteosarcoma; Src; Anoikis; Apoptosis

基金项目：国家自然科学基金(81372864,81602591)；重庆市基础与前沿研究计划重点项目(cstc2015jcyjBX0067)

通讯作者：郭乔楠，教授，本刊编委，E-mail：[e-mail]

【中图分类号】R 73-3

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.02.005

(收稿日期：2016-07-15；

修回日期：2016-11-24； 编辑： 张文秀)