前列腺癌组织中ING4与VEGF的表达及相关性研究*

·论著·

前列腺癌组织中ING4与VEGF的表达及相关性研究*

夏中友 伍季 张萌 李云祥 范俊

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院泌尿外科, 四川 南充 637000)

【摘要】目的 探讨生长抑制因子4(ING4)与血管内皮生长因子(VEGF)在前列腺癌中表达及其对肿瘤发生发展的作用。方法 采用免疫组织化学ElivsionTM Plus二步法检测ING4及VEGF在28例前列腺癌及32例良性前列腺增生组织的表达,比较其在不同前列腺组织中表达差异，并将结果与前列腺癌病理分级、临床分期及PSA值进行分析。结果 ING4在良性前列腺增生组织中阳性表达率明显高于前列腺癌组织，差异具有统计学意义(P<>P>0.05)，但其强阳性表达率在前列腺癌中明显高于前列腺增生组织，且随肿瘤病理分级、临床分期及PSA增加而升高。前列腺癌中ING4表达与VEGF呈负相关(r=-0.655，P<0.05)。结论>

【关键词】ING4； VEGF； 前列腺癌； 免疫组化

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是西方国家最常见的男性恶性疾病，美国癌症协会2015年统计结果显示前列腺癌居男性癌症发病率首位，死亡率居第二位[1]。在我国前列腺癌发病率相对较低，但近年也呈增高趋势，且大部分初诊时已进入晚期或发生转移[2]。根治性前列腺切除手术和放疗对绝大多数器官局限性前列腺癌治疗有效，但仍有约30%的患者出现局部复发及远处转移，给临床治疗带来了极大困难。近年具有肿瘤生长抑制和细胞凋亡作用的基因相继被发现，生长抑制因子(Inhibitor of growth,ING)基因家族成为肿瘤生长抑制基因的研究热点。ING4基因在多种肿瘤细胞中表达降低或缺失，提示可能其参与肿瘤的发生、发展。肿瘤的复发及侵袭主要依赖周围组织的血供，因此，血管生成与肿瘤存在密切关系。研究表明，在结肠癌、乳腺癌中ING4基因可能对肿瘤新生血管形成具有抑制作用。而在前列腺癌组织中关于ING4对肿瘤血管生成的调节，国内外均罕见相关报道。本实验将通过免疫组织化学联合检测ING4及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在28例不同病理分期及危险等级前列腺癌组织中的表达，探讨其在前列腺癌发生发展中可能的作用机制。

1 材料及方法

1.1 临床资料 选择我院病理科2012年1月至2014年12月经尿道前列腺切除术并有完整临床资料石蜡标本，包括前列腺癌患者28例，年龄59～86岁，平均为72岁，良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)患者32例，年龄59～88岁，平均为73岁。按照Gleason评分系统的前列腺癌病理分级，中分化(Gleason 5～6分)3例，低分化(Gleason 7～10分)25例。根据2014年中国泌尿外科指南中前列腺危险因素等级将前列腺癌分为低危(Gleason评分≤6分、PSA<10 ng/ml及≤t2a期)、中危(gleason评分7分或psa10～20="" ng/ml或t2b期)及高危(gleason评分8～10分或psa="">20ng/ml或≥T2c期)，其中低危组3例、中危组6例、高危组19例。

1.2 主要试剂及仪器 鼠抗人ING4多克隆抗体(1∶150稀释)(美国Abcam公司)，鼠抗人VEGF单克隆抗体 福建迈新生物试剂公司，EliVisionTM plus试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。隔水式电热恒温培箱PYX-DHS-40X50(上海跃进医疗器械)，PHY-III病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)，BJM-III 病理组织包埋冷冻台(常州市中威电子仪器有限公司)，珊顿电动切片机 FinesseE+(常州市中威电子仪器有限公司)。

1.3 实验方法 石蜡包埋的前列腺癌及良性前列腺增生组织切成4 μm厚的切片，经脱蜡、水化、抗原修复，余下步骤按EliVisionTM plus两步法试剂盒操作。用已知正常睾丸组织阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 由两位高年资病理科医生对同一组织切片进行结果判定。ING4染色结果判定：ING4 阳性表达以细胞核和 /或细胞质内出现棕黄色颗粒为准；使用半定量的评分系统来评估抗体的染色效果，计数 5 个高倍视野或 500 个细胞。按染色强度计分：0分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色；按阳性细胞所占百分比计分：0 分为阴性，1分为阳性细胞数 ≤10% ，2分为阳性细胞数11%～50% ，3分为阳性细胞数 51%～75% ，4分为阳性胞数 > 75% ；染色强度计分与阳性细胞所占百分比计分乘积：0～2 分为(-)，3～5 分为(+)，6～9分为(++)，10～12分为(+++)。VEGF表达结果判定：细胞浆或细胞膜染色为浅棕色至深棕色者为阳性细胞，阳性细胞计分：1%，0分；1%～10%，1分；11%～50%，2分； 51%～80%，3分；80%，4分。着色强度积分：弱，1分；中，2分；强，3分。两个值相加为最终判定结果：1分(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，6～7分(+++)。

1.5 统计学方法 本实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析，ING4及VEGF在良性前列腺增生及前列腺癌表达，及其与前列腺癌不同病理分级、PSA、临床分期关系采用2检验，以P<>

2 结果

2.1 ING4在BPH和PCa的表达情况 ING4主要表达于细胞核，在胞质及间质中同样有少许表达。BPH中ING4主要表于细胞核中，而PCa组织中胞浆染色较明显，在分化较好的PCa中有少许胞核着色，见图1、2、3。ING4在BPH及PCa中阳性表达率分别为93.75%、50.00%，差异具有统计学意义(P<><10 ng/ml、10～20="" ng/ml及psa大="">20 ng/ml PCa中ING4阳性表达率分别为100%、85.71%、23.53%，差异具有统计学意义(P<>P<>

表1 ING4在BPH及Pca中的染色结果

Table 1 The expression of ING4 in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues

组别ING4-++++++ 2PBPH2522321．7720．000PCa14860

2.2 VEGF在前列腺良性增生组织及前列腺癌中的表达 免疫组化结果显示，VEGF表达定位于前列腺组织血管内皮细胞浆或细胞膜，阳性染色为浅棕色至深棕色，见图4、5、6。VEGF在PCa及BPH中的阳性表达率分别为90.61%、100%，两者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。VEGF的强阳性表达率在PCa中为60.71%,在BPH中为31.25%，两者间比较差异

图1 ING4在BPH组织中的表达(×200)

Figure 1 The cell of BPH showing ING4 protein positive staining (×200)

图2 ING4在中分化PCa组织中的表达(×200)

Figure 2 The cell of middle differentiated prostate cancer showing ING4 protein positive staining (×200)

图3 ING4在低分化PCa组织中表达(×200)

Figure 3 The cell of poorly differentiated prostate cancer showing ING4 protein positive staining (×200)

图4 VEGF在BPH组织中的表达(×200)

Figure 4 The cell of BPH showing VEGF proteinpositive staining (×200)

图5 VEGF在中分化PCa组织中的表达(×200)

Figure 5 The cell of middle differentiated prostate cancer showing VEGF protein positive staining (IHC×200)

图6 VEGF在低分化PCa组织中的表达(×200)

Figure 6 The cell of poorly differentiated prostate cancer showing VEGF protein positive staining (IHC×200)

有统计学意义(P<0.05)。在中分化及低分化前列腺癌组织中vegf强阳性表达率分别为0.00%(0>P<><10 ng/ml、10～20="" ng/ml及psa="">20 ng/ml PCa中VEGF强阳性表达率分别为0.00%、33.33%、78.95%，差异具有统计学意义(P<>P<>

表2 ING4在不同病理分级及不同PSA的PCa中的染色结果

Table 2 The staining results of ING4 in prostate cancer with different pathological grades and different PSA

项目nING4-++++++ 2P病理分级7．0500．012 中分化40130 低分化2414730PSA(ng/ml)17．3540．000 <1040130 10～2071510="">201713400

表3 ING4在不同临床分期前列腺癌组织中的表达

Table 3 The expression of ING4 in different clinical stages of prostate cancer tissues

临床分期nING4-++++++ 2PⅡ期30030Ⅲ期13391032．7610．000Ⅳ期1211100

表4 VEGF在前列腺癌及良性前列腺增生组织中的表达

Table 4 The expression of VEGF in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues

组织nVEGF-++++++强阳性率(×10-2) 2PBPH3237121031．255．2380．002PCa2801101760．71

表5 VEGF在不同病理分级前列腺癌组织中的表达

Table 5 The expression of VEGF in prostate cancer tissues with different pathological grades

病理分级nVEGF-++++++强阳性率(×10-2) 2P中分化301200．004．480．034低分化250091664．00

表6 VEGF在不同PSA前列腺癌组织中的表达

Table 6 The expression of VEGF in prostate cancer tissues with different PSA

PSA(ng/ml)nVEGF-++++++强阳性率(×10-2) 2P<10301200．0010～206004233．339．170．010>20190041578．95

表7 VEGF在不同临床分期前列腺癌组织的表达

Table 7 The expression of VEGF in different clinical stages of prostate cancer

临床分期nVEGF-++++++强阳性率(×10-2) 2PⅡ期301200．00Ⅲ期13006753．8413．6870．008Ⅳ期120021083．33

2.3 PCa中ING4蛋白表达与VEGF之间相关性 随着PCa病理分级及危险等级的增加，ING4基因表达逐渐降低，而VEGF表达逐渐增加，等级相关分析示：在PCa组织中ING4的表达与VEGF表达呈负相关(r=-0.655， P<>

表8 ING4与VEGF在PCa组织中的相关性

Table 8 The relationship of ING4 and VEGF in prostate cancer tissues

ING4nVEGF-++++++rP-1400212+80035-0．6550．000++60150

3 讨论

ING4是生长抑制因子家族中的新成员，最初从脑垂体中分离出来[3]，Suwon等[4]2003年鉴定，并在2004年确定为一种重要的肿瘤抑制因子[5]。ING4蛋白结构与其他ING蛋白结构类似，由组蛋白乙酰基转移酶和染色质诱导的转录调节相关的组蛋白脱乙酰基酶组成,并在其高同源性的N端拥有一个核定位序列,该结构在ING4的核定位以及参与P53基因复合定位有重要作用，C端拥有一个植物同源结构域PHD锌指结构，由Cys4-His-Cys3构成，通过与磷脂酰肌醇磷酸的核受体结合调节细胞生长、增殖及凋亡[6-7]。

ING4主要表达于正常组织细胞核内，但其在多种人类肿瘤(如胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌及肺癌)中表达显著降低，与肿瘤的分级及危险性呈负相关[8-9]，表明其是一个有效的抑癌因子。近年来有相关研究通过腺病毒诱导ING4表达的体内外实验结果显示，ING4基因对乳腺癌、胃腺癌、肝癌及骨肉瘤均有显著的抑癌效应。杨慧翠等[10]及Zhang等[11]以腺病毒介导的人ING4基因(Ad-INC4)分别转染人前列腺癌细胞PC-3及膀胱癌细胞株T-24,结果均显示ING4基因的表达在肿瘤组织中明显降低或缺失。Berger等[12]研究发现ING4基因作为原癌基因Myc及抑癌基因Pten下游的靶基因，在前列腺细胞正常分化中具有重要的作用，ING4基因的缺失可导致前列腺细胞分化异常，从而导致前列腺癌的发生。而国外有研究发现，在裸鼠模型中ING4基因的缺失并没有增加肿瘤形成的几率，表明单一的ING4缺失可能不足以导致肿瘤的发生[13]。

本实验中结果显示：ING4在良性前列腺增生组织中的阳性表达率(93.75%)高于前列腺癌组织(50.00%)。在前列腺癌组织中，随肿瘤分化程度降低、临床分期及前列腺特异性抗原(PSA)增加，ING4基因表达降低。根据2014年泌尿外科指南中前列腺癌危险等级分级，可见随肿瘤危险等级增加，ING4基因表达降低，故ING4表达与病理分级及危险等级呈负相关，这与之前在胃癌及乳腺癌中的研究相符合。因此，我们推测ING4基因具有抑制前列腺癌发生的作用,其表达减低可能与肿瘤的侵袭及转移有关。

肿瘤的生长及浸润离不开新生血管的形成，这一过程涉及了肿瘤细胞的异常增殖、基质的降解、血管生成的等复杂的生理过程。前列腺癌经过手术、放化疗、雄激素去势治疗及免疫治疗后部分患者出现复发、疗效不佳的一个重要原因可能与肿瘤对周围组织的侵袭作用有关。实体肿瘤发生侵袭性生长及远处转移往往依赖血管为其提供氧气及营养物质[14]。研究表明，VEGF在大肠癌[15]、子宫内膜癌[16]、口腔恶性黑色素瘤[17]及膀胱癌等恶性肿瘤中呈高表达，且随着肿瘤临床分期及病理分级水平增加而升高，表明VEGF的表达可能参与了肿瘤的发生发展及远处转移。国内外相关学者对VEGF的表达与前列腺癌的关系做了大量研究，结果均显示在前列腺癌组织中VEGF表达呈强阳性。Stefanou等[14]以免疫组化检测了不同前列腺癌及良性前列腺增生组织VEGF表达，发现前列腺癌组织中VEGF表达明显高于良性前列腺组织，且与前列腺癌临床分期呈正相关。Sharif等[18]研究显示，前列腺癌患者血液中分泌型VEGF明显高于对照组。但也有研究发现VEGF与前列腺癌临床病理分级并不存在相关性[19]。

在良性前列腺增生组织及前列腺癌组织中VEGF的阳性表达率均为100%，彼此之间并无显著差异。其原因可能与VEGF在前列腺组织腺上皮细胞及一些非血管细胞(如巨噬细胞、成纤维细胞及肥大细胞)中均有阳性表达有关[20]。但VEGF良性前列腺增生组织及前列腺癌组织中表达的强阳性率分别为31.25%、60.71%。前列腺癌组织中VEGF强阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<>P<>[14]研究结果相符。前列腺癌分化越低、临床分期越高，VEGF表达越强,这可能与前列腺癌组织中雄激素激活VEGF启动子，使VEGF表达增加，从而促进前列腺癌的侵袭及远处转移有关[21]。

4 结论

ING4在前列腺癌组织中低表达，而VEGF高表达，同时两者具有一定相关性。因此，我们推测ING4的减少或缺失可能增加了VEGF表达，VEGF促进了肿瘤新生血管形成，两者在前列腺癌发生发展及侵袭中具有重要作用。

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Study of expression and correlation of ING4 and VEGF in prostate cancer

XIA Zhongyou,WU Ji,ZHANG Meng,LI Yunxiang,FAN Jun

(Department of Urology, The Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China)

【Abstract】Objective To investigate the expressions of ING4 and VEGF in prostate cancer and relationship of ING4 and VEGF in the development of tumor. Methods Expression of ING4 and VEGF in 28 cases of prostate cancer and 32 cases of benign prostatic hyperplasia were detected by EliVisionTM plus immunohistochemical stain. The immunoassay results were analyzed in relation to the tumor pathological grade, clinical stage and the different PSA. Results The positive expression rate of ING4 gene in prostate cancer tissues was significantly lower than that of benign prostatic hyperplasia, and decreased with the increase of tumor pathological grade, clinical stage and PSA. There was no difference in the positive expression rate of VEGF in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia (P>0.05). But the strong positive expression rate in prostate cancer was significantly higher than that in benign prostatic hyperplasia, and increased with the pathological grade, clinical stage and PSA. The expression of ING4 was negatively correlated with VEGF in prostate cancer, which was statistically significant(P<0.05).conclusion abnormal="" expressions="" of="" ing4="" is="" one="" of="" the="" significant="" factor="" of="" the="" increasing="" of="" the="" degree="" of="" the="" occurrence="" and="" progression="" of="" prostate="" cancer,="" and="" possibly="" play="" a="" role="" in="" tumor="" promotion="" by="" promoting="" tumor="" angiogenesis.="" ing4="" may="" be="" a="" biological="" index="" for="" diagnosis="" and="" treatment="" of="" prostate="">

【Key words】ING4; VEGF; Prostate Cancer; Immunohistochemistry

基金项目：南充市科技局资助项目(14A0071)

通讯作者：伍季，教授，本刊审稿专家，E-mail:wuji2168@ sina.corn

【中图分类号】R 737.25

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.02.009

(收稿日期：2016-10-09； 编辑： 张文秀)