血浆WIF

血浆WIF-1基因启动子甲基化检测在肺癌早期诊断中的临床意义▲

骆江龙 李 鲲 冯 旭 周华富 郑宝石 黄柳柳 廖寿合

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，广西南宁市 530021)

【摘要】目的 检测肺癌患者血浆Wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子的甲基化情况并分析其在肺癌早期诊断中的意义。方法 应用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法，首先检测肺癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，再分别检测78例肺癌患者、40例肺良性病变患者和40例健康志愿者血浆中WIF-1基因启动子区甲基化状态。结果 肺癌患者血清癌胚抗原阳性率为35.90%(28/78)，大致接近血浆标本中WIF-1基因启动子区甲基化率34.62% (27/78)。肺良性病变患者血浆中WIF-1基因启动子区甲基化率为2.50%(1/40),健康志愿者血浆中WIF-1基因启动子区未检测出甲基化。肺癌患者血浆WIF-1基因启动子甲基化和血清癌胚抗原二项联合检测的灵敏度为(62.82%)，特异度为(90.00%)。不吸烟者WIF-1基因启动子甲基化率低于吸烟者。结论 外周血浆中WIF-1基因启动子甲基化有成为肺癌的新的检测手段的可能性，并且对肺癌的初步筛查具有一定的临床意义。

【关键词】甲基化；肺癌；WIF-1基因；巢式甲基化特异性聚合酶链反应

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，调查显示其发病率在各种肿瘤中已排在第一位，发展中国家和发达国家发病率相近。预计到2020年，在中国新增发病和死亡人数最多的癌症仍是肺癌，且男女比例将趋于1 ∶1[1]。目前肺癌的治疗手段有很多，除了常规的手术治疗可起到根治的效果，其他诸如放疗、化疗、生物治疗和中医中药治疗等替代治疗暂无法缓解病情的进展，但是靶向治疗领域的重大突破，也许是未来肺癌患者的福音。可是当前肺癌的复发率和病死率仍然很高，主要原因是在医院确诊为肺癌的患者大部分已处于中晚期阶段[1]。因此，早期诊断和早期治疗在提高肺癌患者的治愈率、减少疾病死亡率及改善患者的预后等方面发挥着显著的作用。

基因启动子区甲基化与恶性肿瘤的发生、发展关系密切，且相关基因甲基化检测有可能成为检测胃癌、乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的新的肿瘤标志物；这对于疾病的鉴别诊断具有很好的作用[2，4]。WIF-1基因在结直肠癌、肺癌等细胞株均呈现高甲基化状态[5-6]。但目前国内外文献并没有研究报道血浆WIF-1基因在肺癌早期诊断的作用，所以，本实验旨在通过利用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测肺癌、肺良性病变和健康患者血浆WIF-1基因异常甲基化，探讨血浆WIF-1基因启动子甲基化检测对于肺癌早期诊断的意义及肺癌WIF-1基因启动子甲基化状态与临床特征的联系。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2014年6月至2015 年10月期间在我院行开胸手术治疗并经本院病理科检测确诊为肺癌的患者78例为研究对象，男57例，女21例，年龄38～82岁，中位年龄64.21岁。根据2015版WHO肺癌组织学分类[7]，鳞癌42例，腺癌36例，恶性程度高55例，恶性程度低23例。按国际抗癌联盟2009年修订的第七版肺癌TNM分期标准[8]，早期28例，晚期50例。患者均排除其他恶性肿瘤病史。同时选择我院呼吸内科同年住院治疗的40例肺部非恶性肿瘤患者为对照组，男28例，女12例，年龄19～84岁，中位年龄60.23岁。对照组均排除肺部或其他器官的恶性肿瘤病史，其中支气管哮喘16例，支气管肺炎9例，支气管扩张5例，COPD 4例，肺结核、特发性间质性肺炎、自发性气胸、胸腔积液、炎性假瘤及肺囊肿各1例。选择40例健康志愿者为健康组，男18例，女22例，年龄51～68岁，中位年龄61.18岁。健康组所有志愿者均为证实无恶性肿瘤及其他呼吸道疾病的体检者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 受试者均于治疗前抽取清晨空腹外周静脉血2 mL，ACD抗凝，2 000 r/min离心15 min分离血浆，再以12 000 r/min离心15 min，获得无血细胞成分的血浆，以1.5 mL试管分装，于-80℃保存待检测。同时调取入院常规的血清癌胚抗原结果，根据试剂盒说明书标示。

1.2.2 血浆DNA提取 采用北京天根生物科技有限公司的血液组织细胞基因组提取试剂盒对组织标本和血浆标本进行基因组DNA提取，提取过程按照试剂盒说明操作。提取结果均采用紫外线分光光度计测定纯度和含量。

1.2.3 亚硫酸氢钠修饰 采用Qiagen公司的Epitect Bisulfite Kit试剂盒进行基因甲基化修饰，具体操作步骤按说明书。

1.2.4 巢式MSP 用于巢式MSP扩增WIF-1基因引物序列见表1，由Invitrogen公司合成，PCR反应体系为25 μL：包含10×PCR Buffer 2.5 μL(含Mg2+)，2.5 mmol/L的 dNTP 2.0 μL，LA Taq DNA聚合酶0.3 μL，10 pmol/L的外侧引物各0.8 μL。具体操作步骤按说明书。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)；灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)[9]。计数资料采用卡方检验或Fisher精确检验法，以P<>

表1 巢式甲基化PCR扩增WIF-1基因的引物序列

Primersequences(5′?3′)Anealing/℃Length/bpOutersenseTCGGTGATTCTGATTCTTG52400Anti?senseAGCTGAATTCGAAATGACCAATInnerMethylatedSenseCTTATTATCGCGCGAAGCAC57146Anti?senseAGTAGCGATGTGGCGATGAGTUnmethylatedSenseAGGGCTACTTGTAGTCGTGCCAC54148Anti?senseTTTATAAGTGACGGATACGTTAGTGTTGC

2 结 果

2.1 血浆WIF-1 基因甲基化检测结果 肺癌患者血浆标本中WIF-1 基因启动子甲基化所占比例为35.90%(27/78)，肺良性病变患者血浆中WIF-1基因启动子甲基化所占比例为2.50%(1/40)；健康志愿者血浆中甲基化所占比例为0%(0/40)。3组WIF-1基因启动子甲基化率比较，差异有统计学意义(P<>

图1 血浆WIF-1基因启动子区nMSP分析结果

Mar：50 bp DNA ladder marker；U：未甲基化；M：甲基化；LC：癌症患者血浆；LN：正常对照血浆 ；P1：非甲基化阳性对照；P2：甲基化阳性对照；Water：空白对照

2.2 WIF-1基因启动子甲基化与临床资料的比较 78例患者血浆中WIF-1基因启动子甲基化状态与临床资料的比较分析，不同性别、年龄、组织学类型、TNM分期和分化程度间WIF-1基因启动子甲基化检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但是吸烟组患者WIF-1 基因异常甲基化率明显高于不吸烟组，差异有统计学意义(P<>

2.3 WIF-1基因启动子甲基化测定对肺癌的诊断效果 将肺癌患者血浆WIF-1基因启动子甲基化的测定结果与血清癌胚抗原测定结果进行比较。血浆WIF-1基因启动子甲基化检测和血清癌胚抗原检测在诊断肺癌方面的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值大致相同，虽然WIF-1基因启动子甲基化检测灵敏度较低，但特异度要高于血清癌胚抗原。WIF-1基因和血清癌胚抗原2项联合检测肺癌可明显提高灵敏度(62.82%)，但特异度有所下降(90.00%)。见表3。

表2 WIF-1基因启动子甲基化状态与临床病理资料的分析(n)

项目n甲基化未甲基化χ2值P值性别 男5718390．0020．883 女21714年龄 <60岁3711260．7420．389 60岁411625吸烟史="" 有4522237．8010．005="" 无33627组织学类型="" 鳞癌4212300．0370．848="" 腺癌361125肿瘤分期="" ⅰ、ⅱ期4013270．1620．687="" ⅳ、ⅴ期381424分化程度="" 低、未分化5517380．4930．482="">

表3 血浆 WIF-1基因启动子甲基化及血清癌胚抗原的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值 (%)

检测项目灵敏度特异度阳性预测率阴性预测率WIF?134．61%(27/78)97．50%(39/40)96．42%(27/28)43．33%(39/90)CEA35．90%(28/78)92．50%(37/40)90．32%(28/31)42．53%(37/87)WIF?1+CEA62．82%(49/78)90．00%(36/40)92．45%(49/53)55．38%(36/65)

3 讨 论

目前大量的文献报道[10]，当前肿瘤研究的热点就是对于外周血中游离的肿瘤相关DNA的研究，并且这项研究对于恶性肿瘤的早期诊断、预后都具有不可低估的作用。表观遗传学研究表明，抑癌基因启动子区的CpG岛发生的异常甲基化对于恶性肿瘤的形成与发展关系密切[11]。研究和探讨血浆中众多基因的异常甲基化，对于恶性肿瘤早期诊断与鉴别诊断具有一定的指导价值。

3.1 WIF-1基因启动子甲基化的实验结果分析 WIF-1基因定位于人染色体12ql4.3，其编码产物为WIF-1蛋白，人的前列腺、肺和脑最多[12]。WIF-1蛋白最先发现于人的视网膜中，它由一个N末端信号序列，C端亲水序列，一个WD区域和5个类似于EPG(Epidermal Growth Factor)的连续结构所构成，是一种在进化上相对保守的分泌型糖蛋白[15]。研究发现人肺癌WIF-1基因启动子区CpG岛过度甲基化可以导致细胞Wnt信号途径呈异常激活，进而引起WIF-1基因的转录沉默，最终发现有83%肺癌组织中WIF-1蛋白表达减少[10]。本研究显示，肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子甲基化检测的灵敏度为34.62%(27/78)，特异度为97.50%(39/40)，结果与上述研究一致。

3.2 癌胚抗原的实验结果分析 癌胚抗原在临床上已经被用于多种肿瘤的早期诊断，是一种广谱的肿瘤标志物，但是其特异性不强，仅仅具有一定的参考价值。本研究发现癌胚抗原水平随着分期越来越高。本研究表明，WIF-1基因启动子的异常甲基化与肺癌的临床分期没有相关性，对比Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者和Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子的甲基化结果，发现差异无统计学意义，这说明WIF-1基因启动子甲基化在肺癌的早期就发生了。这一结果也提示检测血浆WIF-1基因的异常甲基化可作为诊断早期肺癌的一个新的手段。

3.3 肺癌患者和健康志愿者结果比较 本实验结果显示在78例肺癌患者异常甲基化所占比例为34.62%；40肺良性病变患者血浆中仅仅有1例检测到异常甲基化；而健康志愿者血浆中没有检测出WIF-1基因的异常甲基化。这表明WIF-1基因的甲基化与肺癌的发生关系密切。另外还有研究[13]表明肺癌患者的吸烟指数也与WIF-1基因的异常甲基化与有关，本实验结果也证实了该论断。

3.4 联合检测结果分析 有研究表明[14]，联合检测有助于提高肺癌的检出率。本实验综合分析了肺癌患者的WIF-1基因启动子甲基化及血清癌胚抗原，虽然特异度有所下降(90.00%) ，但是灵敏度却有所提高(62.82%)，这说明单个指标的检测也有其不足之处，2个指标的结合作用有利于肺癌的早期筛查。

综上所述，WIF-1基因启动子的异常甲基化伴随着肺癌的发生和发展，也是肺癌产生的机理在基因层面的一种有力解释，异常甲基化的出现也往往表明肺癌的萌芽。采用nMSP法对WIF-1基因进行甲基化检测虽然提高了检测效率，但该方法也存在复杂和耗时长等不利之处，有待于改善。肿瘤的早期筛查不仅仅是靠一项指标就能完成的，这需要多个指标的综合考虑才能起到立竿见影的作用。今后，我们将开展新的甲基化检测方法在肿瘤方面的运用，进而使甲基化检测成为一种常规检测手段。

参 考 文 献：

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Clinical utility of plasma WIF-1 gene promoter methylation detection in the early diagnosis of lung cancer

LUO Jianglong，LI Kun, FENG Xu, ZHOU Huafu, ZHENG Baoshi, HUANG Liuliu, LIAO Shouhe

(Department of Cardiothoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China)

【Abstract】Objective To detect the status of Wnt inhibitory factor-1(WIF-1)promoter methylation in plasma of lung cancer patients and to evaluate its implications in the early diagnosis of lung cancer. Methods The nested methylation specific PCR(nMSP)was used to detect the level of carcinoembryonic antigen(CEA) in the serum of patients with lung cancer，then the status of WIF-1 promoter methylation in the plasma of 78 patients with lung cancer，40 patients with benign lung disease and 40 healthy volunteers was detected. Results The positive rate of CEA was 35.90%(28/78),was similar to 34.61% (27/78) of plasma WIF-1 genes promoter methylation in lung cancer patients. The positive rate of WIF-1 gene methylation in plasma of benign lung disease patients was 2.50%(1/40), The WIF-1 genes methylation in plasma was not discovered in healthy volunteers. The sensitivity of combined detection of plasma WIF-1 gene promoter methylation and serum CEA in patients with lung cancer was 62.82%, and the specificity was 90.00%. The WIF-1 gene promoter methylation rate was lower in smokers than that in non-smokers. Conclusion Plasma WIF-1 genes promoter methylation has the possibility of becoming a new tumor marker in lung cancer. The detection of WIF-1 genes promoter methylation has a certain potential value for the early diagnosis of lung cancer.

【Key words】Methylation；Lung cancer；WIF-1 gene；Nested methylation specific PCR

▲基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(编号：1355005-3-19)

【中图分类号】R 734.2

【文献标识码】A

【文章编号】1673-6575(2017)02-0175-04

DOI：10.11864/j.issn.1673.2017.02.05

(收稿日期：2017-01-18

修回日期：2017-03-15)