广西壮族人群TNF-α基因多态性及其表达与原发性肝细胞癌的相关性研究李艳秋， 朱 波， 欧 超， 赵惠柳， 舒 宏， 容敏华 （广西医科大学附属肿瘤医院检验科，广西 南宁 530021） 摘要：目的探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）-238/-308 2个位点的基因单核苷酸多态性（SNP）及血清TNF-α水平与广西壮族人群原发性肝细胞癌（HCC）的关系及其临床意义。方法将175名研究对象分为HCC组102例和正常对照组73名，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）技术检测血清TNF-α水平并对TNF-α-308/-238 2个位点基因多态性进行分型。结果 HCC组血清TNF-α水平显著高于正常对照组（P＜0.01），携带TNF-α-308 GA+AA基因型的个体血清TNF-α水平表达高于携带TNF-α-308 GG基因型个体（P＜0.01）。HCC组TNF-α-308位点的基因型和等位基因频率均高于正常对照组（P＜0.05），TNF-α-238位点的基因型和等位基因频率在HCC组和正常对照组中的分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。携带TNF-α-308位点GA或AA基因型的个体与携带GG基因型的个体相比发生肝癌的风险更高[比值比OR=3.556，95%可信区间（CI）1.581～7.994]，携带TNF-α-308 A等位基因的个体患HCC的风险是携带G等位基因个体的3.153倍（OR=3.153，95%CI1.465～6.784）。结论HCC患者的血清TNF-α水平高于正常对照组。TNF-α-308位点多态性与血清TNF-α水平有关。TNF-α-308位点多态性可能与广西地区壮族人群HCC的遗传易感性有关。 关键词：肿瘤坏死因子-α；原发性肝细胞癌；单核苷酸多态性；易感性 Key words：Tumor necrosis factor-alpha；Primary hepatocellular carcinoma；Single nucleotide polymorphism；Susceptibility 原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）居常见恶性肿瘤的第五位，每年约有超过60万人死于肝癌，在全球肿瘤相关性死亡中排名第三[1-2]。我国每年新患肝癌病例占全球的55%，而广西是我国肝癌高发地区之一[3]。目前认为肝癌的发生、发展是一个复杂且长期的过程。有研究表明，许多炎症介质和慢性炎症过程被认为是肿瘤形成过程中的辅助因子。目前对HCC的诊断主要依据病理学及影像学诊断技术，对于不能进行病理学检查的肝脏疾病患者来说，仅依靠影像学诊断技术对肝内的良恶性病变进行鉴别很困难，尤其是肝癌与肝炎后肝硬化造成的结节性改变不易鉴别，而多种炎症因子可在病理学及影像学发现异常之前在血清表达水平上发生变化，对疾病及恶性肿瘤的发现起到监测和预警作用[4]。其中，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）被认为是炎症相关性肿瘤形成中的最重要的细胞因子[5-7]。TNF-α参与了肝损伤、肝纤维化及肝癌的病理发生发展过程[8]。而TNF-α基因启动子区域中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）影响TNF-α的蛋白表达水平，从而使不同个体对不同疾病的易感性和疾病进程有所不同[9]。 本研究通过对TNF-α-238（rs361525）和TNF-α-308（rs1800629）这2个位点的多态性进行基因分型并检测血清TNF-α含量水平，以探讨其与HCC的关系及其临床意义。 1 材料和方法1.1 对象 选取2015年7—12月在广西医科大学附属肿瘤医院经影像学检查及病理学检查初次诊断为HCC的患者共102例，其中男86例，女16例。年龄28～84岁。HCC确诊采用我国发布的2011年版HCC诊断标准[10]。正常对照组按性别、年龄与病例组匹配，选取同期住院无血缘关系的非肿瘤患者（临床和实验室检查均正常，无家族肿瘤病史）共73名，其中男57名，女16名。年龄24～86岁。2个组的年龄、性别的分布差异均无统计学意义（P＞0.05），所有研究对象均为广西壮族人。 1.2 仪器与试剂 TNF-α检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。小量全血基因组DNA快速提取试剂盒、dNTPs（北京艾德莱生物科技有限公司）。Taq DNA聚合酶、MspⅠ、NcoⅠ（日本TaKaRa公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。琼脂糖（西班牙Biowest公司）。ProFlex PCR仪（美国Life Techonlogies公司）。TriStar LB941多功能酶标仪（德国Berthold Technologies公司）。Universal Hood III 凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。DYCP-31DN电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。 1.3 血清TNF-α水平检测 抽取研究对象空腹外周静脉血3～5 mL，2 000×g离心10 min，分离血清置于-20 ℃冰箱保存。血清TNF-α水平检测采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），实验操作严格按照说明书进行。 1.4 TNF-α-308和TNF-α-238位点基因多态性检测 1.4.1 模板DNA的提取 抽取研究对象外周静脉血3～5 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用小量全血基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。经核酸浓度检测仪检测后A260/A280值在1.8～2.0之内认为DNA纯度合格，置于-20 ℃冰箱。 1.4.2 引物的设计合成以及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增TNF-α-238和TNF-α-308位点扩增引物参照文献[11-12]设计，TNF-α-238位点引物序列：F：5'-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3'，R：5'-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3'，产物条带长152 bp。TNF-α-308位点引物序列：F：5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'，R：5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'，产物条带长117 bp。PCR反应体系总体积为25 μL，其中包含DNA模板1 μL，10×PCR缓冲液（Mg2+Plus） 2.5μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 u/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，灭菌双蒸水17 μL。PCR反应条件：TNF-α-238为95 ℃预变性反应5 min，94 ℃ 45 s、60 ℃30 s、72 ℃ 45 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；TNF-α-308为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR结束后取扩增产物6 μL经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察扩增产物条带电泳位置并结合DNA相对分子质量标准判断其是否为目的片段。 1.4.3 PCR产物的限制性酶切反应产物分析 取10 μLTNF-α-238/-308 PCR产物与限制性核酸内切酶MspⅠ或NcoⅠ于37 ℃水浴箱中水浴过夜。终止反应后，取TNF-α-238/-308酶切产物10 μL经2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察酶切结果。TNF-α-238基因型有3种情况：为G/G野生型纯合子时，PCR产物含MspⅠ酶切位点，完全酶切，电泳出现133和19 bp 2条条带；为G/A突变型杂合子时，不完全酶切，电泳出现152、133和19 bp 3条条带；为A/A突变型纯合子时，不产生酶切，电泳后只出现152 bp 1条条带。TNF-α-308基因型有3种情况：为G/G野生型纯合子时，PCR产物含NcoⅠ酶切位点，完全酶切，电泳出现87和20 bp 2条条带；为G/A突变型杂合子时，不完全酶切，电泳出现107、87和20 bp 3条条带；为A/A突变型纯合子时，不产生酶切， 电泳后只出现107 bp 1条条带。 1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据中所有计量资料用 2 结 果2.1 TNF-α-238/-308 PCR产物及核酸内切酶琼脂糖凝胶电泳 TNF-α-238位点PCR产物条带长152 bp，经限制性内切酶MspⅠ酶切后，只出现了G/G野生型纯合子（133 bp、19 bp）和G/A突变型杂合子（152 bp、133 bp、19 bp）2种基因型。TNF-α-308位点PCR产物条带长107 bp，经限制性内切酶NcoⅠ酶切后，出现了G/G野生型纯合子（87 bp、20 bp）、G/A突变型杂合子（107 bp、87 bp、20 bp）和A/A突变型纯合子（107 bp）3种基因型。见图1、图2。  图1 TNF-α-238 PCR产物及MspⅠ酶切产物的2%琼脂糖凝胶电泳 注：1为A/A突变型纯合子（107 bp）； 2为G/G野生型纯合子（87 bp、20 bp）；3和4为G/G野生型纯合子（133 bp、19 bp）；5为TNF-α-238 PCR扩增产物；M为100 bp DNA marker ladder  图2 TNF-α-308 PCR产物及NcoⅠ酶切产物的2%琼脂糖凝胶电泳 注：1为A/A突变型纯合子（107 bp）； 2为G/G野生型纯合子（87 bp、20 bp）；3和4为G/G野生型纯合子（133 bp、19 bp）；5为TNF-α-238 PCR扩增产物；M为100 bp DNA marker ladder 2.2 TNF-α-238/-308多态性分析 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，正常对照组TNF-α-238/-308基因型的预期数与观察数分布差异无统计学意义，TNF-α-238/-308基因型频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（TNF-α-238：χ2=0.05，P＞0.05；TNF-α-308：χ2=0.22，P＞0.05），正常对照组样本具有群体代表性。TNF-α-238基因型在HCC组和正常对照组的分布差异无统计学意义（P＞0.05），TNF-α-238 G/A等位基因在HCC组和正常对照组的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。TNF-α-308基因型在HCC组和正常对照组的分布差异有统计学意义（P＜0.01），TNF-α-308 G/A等位基因在HCC组和正常对照组的分布差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。 以是否患肝癌为因变量， 以TNF-α-308基因分型为自变量进行非条件Logistic回归分析，结果显示，携带TNF-α-308 GA+AA基因型的个体患HCC的风险是携带GG基因型细胞个体的3.556倍（OR=3.556，95%CI1.581～7.994），携带TNF-α-308 A等位基因的个体患HCC的风险是携带G等位基因个体的3.153倍（OR=3.153，95%CI1.465～6.784），表明A等位基因可能是HCC的遗传易感基因。 表1 HCC组和正常对照组的TNF-α-238/-308基因型及等位基因分布频率 [例（%）]  注：与正常对照组比较， *P＜0.01 TNF-α-238 GG GA+AA G A GG GA+AA G A HCC组68（66.64）*33+1（33.36）*169（82.84）*35（17.16）*83（81.37）*19+0（18.63）*185（90.69）*19（9.31）*正常对照组64（86.30） 9+0（13.70） 137（93.84） 9（6.16） 60（82.19）13+0（17.81） 133（91.10） 13（8.90）分组 TNF-α-308 2.2 HCC组和正常对照组的血清TNF-α水平比较 HCC组血清TNF-α水平为（1 042.942 ± 995.881）pg/mL，正常对照组为（491.437 ± 283.702）pg/mL，HCC组血清TNF-α水平明显高于正常对照组（P＜0.01）。见表2。 表2 HCC组和正常对照组血清TNF-α 水平比较（  注：与正常对照组比较， *P＜0.01 分组 例数 TNF-α HCC组 102 1 042.942±995.881*正常对照组 73 491.437±283.702 2.3 TNF-α-238/-308不同基因分型的血清TNF-α含量水平比较 TNF-α-238/-308按基因型分类，TNF-α-238 GA+AA基因型与TNF-α-238 GG基因型相比，其血清TNF-α水平差异无统计学意义（P＞0.05），携带TNF-α-308 GA+AA基因型个体的血清TNF-α水平表达高于携带TNF-α-308 GG基因型的个体（P＜0.01）。见表3。 表3 TNF-α-238/-308不同基因分型血清TNF-α水平比较（  注：与TNF-α-308 GG基因型比较， *P＜0.01 基因型 例数 TNF-αTNF-α-308 GA+AA 42+1 1 444.655±1 056.165*TNF-α-308 GG 132 603.832±612.399TNF-α-238 GA+AA 32+0 710.792±663.702#TNF-α-238 GG 143 833.551±860.614 3 讨 论TNF-α是肿瘤微环境中常见并具有代表性的细胞因子，其是由单核巨噬细胞、T细胞和非造血细胞等产生，具有炎症介质、免疫调节等多种生物学功能，是细胞因子调控网络中的重要枢纽之一[13]。人类TNF-α基因在第6号染色体p21.3区域，位于白细胞相关抗原（human leukocyte antigen，HLA）III类基因区内[14]。TNF-α参与了肝损伤、肝纤维化及肝癌的病理发生发展过程[15]，TNF-α启动子区域基因的多态性可能与TNF-α的诱导表达及肝癌的易感性有关。 有研究表明，TNF-α-308位点的基因单核苷酸多态性可影响血清TNF-α的表达，当G被A替代后，TNF的转录水平增高，而血清TNF-α水平是通过正反馈来调节分泌，因此TNF-α-308基因多态性可以影响TNF-α基因转录效率，导致血清TNF-α水平的差异并最终影响多种肿瘤的易感性及其疾病发生、发展过程[16-18]。本研究结果表明，HCC患者与正常人群相比，其血清TNF-α水平显著增高，且携带TNF-α-308 GA+AA基因型个体的血清TNF-α水平表达高于携带TNF-α-308 GG基因型的个体，而TNF-α-238基因多态性与血清TNF-α水平表达无相关性。贾绮宾等[19]研究显示，肝癌患者血清TNF-α水平明显高于肝炎后肝硬化患者，且随肝癌的有效治疗血清TNF-α水平逐渐下降， 而随病情进展血清TNF-α水平明显上升。LOUIS等[20]的研究发现TNF-α-308 A等位基因携带者其血清TNF-α水平比G等位基因携带者高。蒲杰等[21]的研究发现，在早产患者胎盘和母血中TNF-α-308水平GA+AA基因型组高于GG基因型组。 本研究的TNF-α-238/-308基因分型结果显示，HCC组的TNF-α-308 携带GA+AA基因型的个体多于正常对照组。经非条件Logistic回归分析，携带TNF-α-308 GA+AA基因型的个体患HCC的风险是携带GG基因型的个体的3.556倍（OR=3.556，95%CI1.581～7.994），这表明TNF-α-308 A等位基因可能是HCC的危险因素。宋韶芳等[11]的研究表明，肝癌患者携带TNF-α-308 A等位基因的频率较高，携带TNF-α-308 A等位基因无论是纯合子还是杂合子都有更高的患肝癌风险，TNF-α-308 A等位基因可能是肝癌的遗传易感基因。HO等[22]研究发现TNF-α-308 A等位基因携带者与G等位基因携带者相比患肝癌的风险增加3.5倍。郭绪峰等[23]的Meta分析结果提示，在肝癌患者中TNF-α-308 A等位基因的频率明显高于正常对照组，说明G等位基因突变为A等位基因是诱发肝癌的一个重要危险因素。本研究结果与先前的研究结果一致。 TNF-α-238基因多态性与肝癌的相关性报道较少，且研究结果缺乏一致性。本研究结果显示，TNF-α-238位点的基因型在HCC组和正常对照组中的分布没有差别，说明TNF-α-238位点的基因SNP与HCC的易感性无关。王崇科等[18]的研究结果显示，TNF-α-238位点基因多态性可能与广西肝癌家族聚集无关联。YANG等[24]在有关细胞因子基因多态性与肝癌易感性的Meta分析中表明，对于TNF-α-238基因型来说，尚没有足够证据说明其与肝癌易感性有关，而TNF-α-308基因多态性与肝癌易感性相关，特别是在亚洲人群中，这与本研究结果相同。黄海玲等[12]的研究发现携带TNF-α-238 GA基因型个体患肝癌的风险约是GG 基因型的2.786倍，这与本研究结果不符，原因可能与样本量、研究方法及不同地域人群的基因分布差异有关。 综上所述，本研究结果表明，HCC患者血清TNF-α水平比正常对照人群高，血清TNF-α水平与TNF-α-308基因多态性有关，TNF-α-308位点基因多态性与肝癌易感性有关，而尚未发现TNF-α-238位点与肝癌的发生、发展有关。由于本研究标本量较少，且研究对象为广西壮族人群，所以此结论需更大的样本量来验证。本研究从基因多态性角度分析探讨了TNF-α与肝癌在肝癌发生、发展中的分子作用机制，以及测定了血清TNF-α水平，给肿瘤的预防、诊断、个体化治疗及预后判断提供了新的思路与方法。 参考文献： [1]LLOVET J M，BURROUGHS A，BRUIX J. 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Abstract：ObjectiveTo investigate the correlations of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α） -238/-308 single nucleotide polymorphism（SNP） and serum TNF-αlevels with primary hepatocellular carcinoma （HCC）in Guangxi Zhuang population.MethodsA total of 175 subjects were classified into primary HCC group（102 cases） and healthy control group（73 cases）. Serum TNF-α levels and the genotypes ofTNF-α-238/-308 SNP were determined by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and polymerase chain reaction（PCR）-restriction fragment length polymorphism（RFLP）.ResultsSerum TNF-α levels in primary HCC group were higher than those in healthy control group（P＜0.01）. For the genotype ofTNF-α-308，serum TNF-α level of GA+AA genotype was higher than that of GG genotype（P＜0.01）. The genotype and allele frequencies ofTNF-α-308 in primary HCC group were higher than those in healthy control group（P＜0.05）. The genotype and allele frequencies ofTNF-α-238 in primary HCC group and healthy control group had no statistical signifcance（P＞0.05）. The risk of primary HCC was higher inTNF-α-308 GA or AA genotype than that inTNF-α-308 GG genotype [odds ratio（OR）=3.556，95% confdence interval（CI）1.581-7.994]. The risk inTNF-α-308 A allele was 3.153 times higher than that inTNF-α-308 G allele （OR=3.153，95%CI1.465-6.784）.ConclusionsSerum TNF-α levels in primary HCC group are higher than those in healthy control group.TNF-α-308 SNP are correlated to serum TNF-αlevels.TNF-α-308 SNP may be correlated to the genetic susceptibility of primary HCC in Guangxi Zhuang population. （收稿日期：2016-04-06） （本文编辑：范基农） 文章编号：1673-8640（2017）01-0035-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.01.009 基金项目：广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053170） 作者简介：李艳秋，女，1990年生，主要从事分子生物学研究。 通信作者：朱 波，联系电话：0771-5605891。 |
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