重组人癌胚抗原的原核表达及其在质控品中的应用李江峰，宋晓丽，钱 伟，矫丽媛，赵晓妮，王继华，才 蕾 （国家地方联合自检型快速诊断工程实验室 广州万孚生物技术股份有限公司研发中心质控品实验室，广东 广州 510641 ） 摘要：目的 原核表达人癌胚抗原（CEA），并将重组蛋白作为原材料应用在质控品的开发中。方法 利用基因工程方法构建原核表达载体pCold1-cea，通过大肠埃希菌 BL21 （DE3）进行原核表达得到重组人癌胚抗原（rhCEA）。结果 得到了rhCEA的包涵体，经纯化及透析复性后得到可溶的、具有免疫活性形式的重组蛋白，并将其利用在质控品的研制中。研制出的质控品在Abbott平台上的检测结果为：高值235.35 ng/mL，中值68.04 ng/mL，低值11.97 ng/mL；在Roche平台上的检测结果为：高值32.27 ng/mL，中值7.99 ng/mL，低值1.35 ng/mL；在Wondfo平台上的检测结果为：高值5 ng/mL，中值和低值未能检出。结论 原核表达的rhCEA在不同检测平台上的检测结果相差较大。rhCEA质控品更适用于Abbott平台，而不适合于其他2种平台。 关键词：原核表达；癌胚抗原；包涵体；质控品 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一种位于肿瘤细胞质膜表面的膜结合糖蛋白［1-2］。正常情况下，CEA经胃肠道代谢，其在血清中的含量低于2.5 ng/mL，当肿瘤发生时，CEA会进入血液和淋巴循环，引起血清CEA增高，如结肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌患者等［3］。大量研究证实，CEA可诱导机体产生特异性细胞和体液免疫，是肿瘤发生时一个重要的衡量指标，因此CEA作为肿瘤标志物被越来越多地应用于癌症的检测和筛选［4-5］。国内对CEA的真核及原核表达已有报道，但都是同其他基因一起的融合表达，而原核表达也只表达了CEA蛋白的一部分（短肽）［6-7］，且多应用于CEA的基础医学研究。本研究在以往研究的基础上通过原核表达的方法获得了有免疫学活性的重组人癌胚抗原（recombinant human carcinoembryonic antigen，rhCEA）蛋白，并应用于体外诊断试剂质控品的开发领域，降低了CEA的临床质量控制成本，为该领域未来的发展提供了值得借鉴的经验。 材料和方法一、试剂和仪器 菌株大肠埃希菌DH5α、BL21（DE3），原核表达载体pCold1（4.4 kb，His标签），限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ（大连宝生物工程有限公司），Solution I连接酶试剂盒（大连宝生物工程有限公司），透析袋（截留孔径8 000～14 000，上海生工生物工程有限公司），Ni-NTA柱（GE公司），AKTA Purifier System（GE公司），Gel Doc XR+成像系统（BIORAD公司），Nanodrop 2000超微量分光光度计（Thermo公司），朗道免疫复核质控品（IMMUNOASSAY PREMIUM，批号1293EC，朗道实验诊断有限公司）等。 二、方法 1.CEA核酸序列的优化及合成 CEA蛋白（PDB蛋白质数据库索引号P06731）全长为702个氨基酸（amino acid，aa）。其中，1～34aa为信号肽序列，人体内成熟形式的CEA不仅切除了位于N端的信号肽序列，也切除了位于C端的686～702aa序列［8］。因此，本研究中人工合成的核苷酸序列只编码35～685aa。人工合成的核苷酸序列（5' 端BamHⅠ和3' 端HindⅢ）用DNAstar软件加以优化，使其在大肠埃希菌中能够顺利表达［9］。 2.原核表达载体pCold1-cea的构建 利用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶及连接酶试剂将合成得到的cea片段插入到原核表达载体pCold1中，经化学转化及抗性筛选后得到其DH5α菌株，提取质粒并进行质粒酶切鉴定。 3.BL21（DE3）pCold1-cea菌株的构建及rhCEA的诱导表达 将重组表达载体pCold1-cea转化到原核表达菌株BL21（DE3）中，经抗性筛选得到阳性克隆菌株。挑取阳性克隆菌株的单克隆到5 mL的LB培养基中进行过夜培养，然后吸取2 mL过夜培养的菌株到400 mL新鲜的LB培养基中，37 ℃扩大培养2～3 h至其吸光度（A）600为0.4～0.6。此时，加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）并于20 ℃诱导培养12～16 h。pCold1载体带有大肠埃希菌冷休克基因之一的cspA基因启动子，因此需要在低温下诱导（一般选择25 ℃或以下）［10］。离心收集诱导培养的菌株，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及Western blotting方法分析重组蛋白的表达情况。 4.rhCEA包涵体的分离、纯化及复性 收集诱导后的菌体进行超声破碎处理，15 000×g离心15 min后收集包涵体，并用包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，2% Triton X-100，pH值8.0）对包涵体洗涤2～3次，最后用20 mmol/L Tris-HCl （pH值8.0）洗涤去除Triton X-100。用包涵体溶解缓冲液（20 mmol/ L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH值8.0）对rhCEA包涵体进行溶解（室温溶解4 h），离心去除不溶物。将溶解好的rhCEA包涵体进行过滤（220 nm孔径的一次性滤膜）后，在AKTA纯化仪上用Ni-NTA柱纯化，纯化过程中用到的缓冲液有上样缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH值8.0），洗脱缓冲液B（20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，500 mmol/L咪唑，pH值8.0）。上样结束后要用90%的A液+10%的B液对Ni-NTA柱进行洗涤，以除去非特异性结合的杂蛋白。最后用洗脱缓冲液B洗脱，得到已纯化的rhCEA，并利用透析复性的方法对其进行复性。透析之前，用上样缓冲液A对已纯化的rhCEA进行稀释，使其终浓度不高于0.2 mg/mL。复性过程中用到的缓冲液包括：复性缓冲液A （20 mmol/L Tris-HCl，0.8 mol/L尿素，500 mmol/L L-精氨酸，1.33 mmol/L 氧化型谷胱甘肽，3.99 mmol/L 还原谷光甘肽，1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH值8.0），复性缓冲液B（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，20%甘油，0.05%NaN3，pH值8.0），透析复性过程在4～8 ℃进行。 5.rhCEA质控品的制备及性能检测 分别利用Gel Doc XR+成像系统，Nanodrop 2000分光光度法及Bradford方法检测复性后rhCEA的纯度及浓度。筛选质控品配方，并用所选配方对复性后的rhCEA进行稀释，得到一定浓度的CEA质控稀释液，500 μL分装后于-80 ℃预冻2～4 h，然后用真空冷冻干燥机对分装好的CEA质控品进行冻干处理。对冻干后的质控品进行温度测试，检测其热稳定性，并利用体外检测平台进行免疫学检测。 结 果一、原核表达载体pCold1-cea的酶切鉴定 从LB抗性板上挑取单克隆菌株DH5α pCold1-cea进行培养，并提取重组质粒，利用BamHⅠ和HindⅢ对其进行酶切鉴定，pCold1载体经限制性内切酶消化后的大小为4 395 bp，cea片段的大小为1 959 bp。重组表达载体pCold1-cea已被成功构建。见图1。  图1 重组质粒pCold1-cea的酶切鉴定 注：1为重组质粒被BamHⅠ和HindⅢ酶切后的结果；2为重组质粒pCold1-cea；M为DNA Marker 二、rhCEA的诱导表达及检测 挑取原核表达菌株的单克隆，在不同的温度条件下进行培养，并用不同浓度的IPTG进行诱导，诱导培养结束后用SDS-PAGE［图2（a）］及Western blotting［图2（b）］方法分析目的蛋白的表达情况。 由图2（a）可以看出， rhCEA蛋白被成功表达，并形成包涵体。图2（b）则进一步确定了rhCEA的表达。在对诱导条件进行优化的过程中，使用不同浓度的IPTG（0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L）及诱导温度（15、20、25℃）等对表达菌株进行诱导，发现目的蛋白的表达量（约为30%）没有明显升高，且重组蛋白在低温及低浓度IPTG条件下依然以包涵体的形式存在。 三、rhCEA包涵体的纯化及复性 rhCEA包涵体经过Ni-NTA柱纯化后进行SDS-PAGE检测，见图3。  图2 原核表达rhCEA蛋白的分析及检测 注：（a）为目的蛋白表达情况的SDS-PAGE分析，菌株BL21（DE3） pCold1-cea经诱导培养后利用超声进行破碎，分别对破碎后的沉淀（泳道1）、上清（泳道2）、诱导后的菌体总蛋白（泳道3）、未诱导的菌体总蛋白（泳道4）等进行分析；（b）为Western blotting检测目的蛋白的表达，C为BL21（DE3）菌株经诱导培养后的菌体总蛋白，作为阴性对照；5为菌株BL21（DE3） pCold1-cea经诱导培养后的菌体总蛋白；M为预染蛋白Marker；箭头所指为rhCEA重组蛋白的位置  图3 已纯化rhCEA的SDS-PAGE检测 注：1为纯化后的rhCEA蛋白；M为蛋白Marker 由图3可知，利用Ni-NTA柱成功地对rhCEA蛋白进行纯化，其纯度在90%以上。用上样缓冲液A对已纯化的rhCEA进行稀释，使其终浓度＜0.2 mg/mL，然后用截留孔径为8 000～14 000的透析袋进行透析复性，得到了rhCEA的可溶形式。 四、rhCEA质控品的制备及其在不同平台上的检测 为了运输及保存的方便，选择冻干粉型为质控品的制备类型。选择合适的缓冲体系、赋形剂、保护剂（健康人血清等）、防腐剂（叠氮化钠等）等有利于质控品稳定的添加剂作为质控品制备的基质材料。对复性后的rhCEA进行蛋白浓度测定后，用质控品基质将其稀释为高、中、低3个浓度，分别为400、175、50 ng/mL，分装（500 μL/瓶）后放置于-80 ℃冰箱2～4 h，然后于真空冷冻干燥机中进行冻干处理，得到冻干粉型的rhCEA质控品，于4 ℃保存。 1.rhCEA质控品37 ℃稳定性检测 将rhCEA质控品置于37 ℃恒温箱，于不同的时间取出，加500 μL去离子水复溶后，对其进行检测（表1）。以质控品靶值×（1±0.25）为质控品靶值范围来衡量质控品的稳定性，检测平台为Abbott平台（化学发光法）。 表1 rhCEA质控品37 ℃稳定性检测结果  注：*为质控品从冷冻干燥机取出后测得的初始值，将此值作为靶值；低、中、高浓度的靶值范围分别为8.98～14.96、51.04～85.05、176.51～294.19 37 ℃处理时间（d）浓度水平（ng/mL）低中高0*11.9768.04235.35 311.4568.76237.16 511.8267.54233.79 712.1766.83229.39 911.3767.42224.53 1111.4467.73227.47 由表1可知，rhCEA质控品在Abbott平台上测得的初始值与其冻干前的浓度值存在一定的差异，rhCEA经冻干后在Abbott平台上检测时的收率在20%～50%之间，37 ℃处理11 d后其活性值没有较大的变化。 2.rhCEA质控品开瓶稳定性检测 加500 μL去离子水将rhCEA质控品复溶后，放置于室温（25 ℃），于不同的时间点对其进行检测（表2）。以质控品靶值×（1 ± 0.25）为质控品靶值范围来衡量质控品的开瓶稳定性。检测所用平台为Abbott平台。 表2 rhCEA质控品开瓶稳定性检测结果  注：低、中、高浓度的靶值范围分别为8.98～14.96、51.04～85.05、176.51～294.19 25 ℃处理时间（h）浓度水平（ng/mL）低中高011.9768.04235.35 411.2568.38236.13 811.4367.54233.97 2411.0168.06233.79 4811.2667.89234.34 9610.6367.92232.45 由表2的结果可知，rhCEA质控品在96 h之内的开瓶稳定性较好，检测值未出现较大波动。 3.rhCEA质控品在不同平台上的检测结果 将rhCEA质控品复溶后，分别在Abbott （化学发光法）、Roche（化学发光法）以及Wondfo（免疫荧光侧向层析法）平台上进行检测，同时与购买的朗道免疫复合质控品的低、中、高（朗道免疫复合质控品在各个平台上的赋值不同于rhCEA质控品）3个浓度水平在这3个平台上的检测结果进行比较分析，见表3。 表3 rhCEA质控品及朗道免疫复合质控品在不同平台上的检测结果  rhCEA质控品浓度水平（ng/mL）检测平台朗道免疫复合质控品浓度水平（ng/mL）低中高低中高Abbott11.9768.04235.353.5322.1050.70 Roche1.357.9932.272.7316.9037.70 Wondfo…… 5.003.7029.3070.50 由表3的检测结果可知，rhCEA质控品在不同的检测平台上的检测结果有较大的差别。朗道免疫复合质控品在不同平台上的检测结果也有差别，但差别没有rhCEA质控品所表现的明显，其检测值整体趋于一致。 讨 论人源天然状态下的CEA蛋白为糖蛋白，其相对分子质量约为180 000，其碳水化合物的含量约占整个相对分子质量的2/3。由于原核表达系统缺乏蛋白质翻译后修饰的功能，如磷酸化、糖基化等，所以rhCEA蛋白天然人源与CEA蛋白相差较大。有研究表明，去掉CEA蛋白的部分糖链或糖基基团对其生物学活性影响不大［11］，但糖链的完全缺乏却会导致其不能形成正确的空间结构，在透析复性的过程中难以恢复完整的构像，在较大程度上影响了其与特异性抗体的免疫反应，尤其是针对糖链或构象表位的抗体，其体外免疫反应可能减弱甚至不能发生。 rhCEA质控品在不同检测平台上的检测结果表明，rhCEA抗原与不同平台所使用的抗体的免疫反应相差较大，在Abbott平台上表现良好，但在其他2个平台上则出现较大差别，因此本研究获得的rhCEA重组蛋白作为质控品抗原原材料有较大的平台限制。而朗道免疫复合质控品在这3个平台上表现出较好的一致性，这与其所使用的人源CEA蛋白有关，但是人源蛋白的来源及价格都对其作为质控品有较大的限制。由于原核表达系统具有成本低、技术难度低、周期短、表达量高（对于大多数蛋白）、容易培养等诸多的优点，其他一些缺乏糖基化或磷酸化修饰的人源蛋白在不考虑应用真核表达系统的前提下（如酵母、昆虫细胞等），通过添加或调整L-精氨酸、NaCl、氧化型谷胱甘肽/还原谷胱甘肽氧化还原体系、甘油、pH值等［12-13］，进一步优化透析复性的过程，在较大程度上能够得到与天然结构接近的重组蛋白，其不但具有较好的免疫反应性，同时也具有一定的生物学活性，因而在重组蛋白质控品的应用领域前景较好。 综上所述，本研究成功利用大肠埃希菌表达并得到了rhCEA蛋白，虽然其作为质控品抗原原材料具有一定的平台局限性，仅适合于实验中所用到的3个平台中的Abbott平台，但利用该方法对其他临床检验所用质控品原材料进行替换尝试，有助于降低某些特定检测平台的质控成本，为今后其他类型质控品抗原原材料的替换提供了值得借鉴的经验。 参考文献 ［1］OHANNESIAN DW，LOTAN D，THOMAS P，et al. 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Prokaryotic expression of recombinant human carcinoembryonic antigen and its application in quality control materials LI Jiangfeng，SONG Xiaoli，QIAN Wei，JIAO Liyuan，ZHAO Xiaoni，WANG Jihua，CAI Lei. Abstract：Objective To use prokaryotic cell to express human carcinoembryonic antigen（CEA），and use it in the development of quality control materials. Methods Gene engineering methods were used to construct prokaryotic expression vector pCold1-cea，and the vector was transferred into Escherichia coli BL21（DE3） to express recombinant human carcinoembryonic antigen（rhCEA）. Results The inclusion bodies of rhCEA were formed in Escherichia coli BL21（DE3） after purification and refolding，which was used into the preparation of quality control materials. The results of quality control materials on Abbott platform were 235.35 ng/mL for high level，68.04 ng/mL for middle level and 11.97 ng/mL for low level. The results on Roche platform were 32.27 ng/mL，7.99 ng/mL and 1.35 ng/mL for high，middle and low levels，respectively. The results on Wondfo platform were 5 ng/mL for high level，and the results for middle and low levels had not been determined. Conclusions Quality control materials prepared by rhCEA have been analyzed in different analysis systems with obvious determination results. The quality control materials are more suitable for Abbott platform than the other 2 platforms. Key words：Prokaryotic expression；Carcinoembryonic antigen；Inclusion bodies；Quality control materials 文章编号：1673-8640（2016）09-0825-05 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.09.020 （收稿日期：2016-01-08） （本文编辑：李 欣） 作者简介：李江峰，男，1987年生，硕士，主要从事体外诊断工作。 |
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