那些发着诡异之光的实验技术们

微笑如酒 2017-06-11

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最近几天的头条是：心疼浙江考生

一条早已死亡但眼中却闪着诡异之光的草鱼，给很多浙江考生留下了心理阴影，很多考生表示：往后再也不吃豆腐鱼汤了，改吃西红柿蛋汤，看到鱼就一股寒意。

和草鱼诡异的目光不同，那些实验中可以发光的技术则是分子机制研究的实验必备。

（一）荧光素酶报告系统

技术目的：验证核酸-核酸互作、核酸-蛋白互作
举例：miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA、转录因子-启动子等
核心原理：通过X、Y分子的作用原理，将其移植到荧光素酶报告载体上，通过荧光素酶催化的荧光强弱，判断X、Y互作强度。

Fluorescein和Luciferin都是荧光素，但是荧光素酶报告系统中的指的是Luciferin（虫荧光素），在荧光素酶报告基因载体的荧光素酶编码区的3’UTR插入ncRNA或者mRNA的结合序列，然后将构建好的载体转染细胞并调控细胞中相应miRNA的表达水平，通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRNA或者mRNA是否含和某miRNA有互作关系。

若要研究转录因子X-启动子Y作用，就把此启动子替换荧光素酶编码区的启动子，调控细胞中的转录因子X表达水平，检测荧光强度。

萤光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali'的萤火虫体内的萤光素酶

（二）EGFP报告基因

技术目的：在表达载体中，将目的基因克隆到EGFP序列的上游，通过检测EGFP的荧光来检测目的基因的表达量以及物理分布。
核心原理：该EGFP位于该基因下游，EGFP的表达代表着上游基因的表达。

EGFP绿荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Portein)，单体由238个氨基酸构成，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，其发光过程不同于荧光素，是不需荧光素酶参与的，光激发GFP荧光是一个特异性的独立过程，并不需要任何的协同因子、底物，是一个优良的报告基因，其来自于水母的基因表达产物。

(三) 鲁米诺荧光

技术目的：通过荧光强度反应辣根过氧化酶等酶类含量，酶类浓度通常和反应中级联放大反应有关，可最终确定起始目标检测物的含量。
核心原理：荧光强度—辣根过氧化酶含量—抗体含量—抗原丰度。
相关技术：WB、化学发光ELISA、IHC、FISH等

鲁米诺（luminol）是一种化学荧光分子，在过氧化氢分子存在的条件下可以转变成激发态氨基邻苯二甲酸，后者发出较强的荧光。生物系统中的一些酶如辣根过氧化物酶HRP，以及一些金属化合物如血液中的铁，可以催化经过过氧化氢的分解，使过氧化氢变成水和单氧，其中单氧可氧化鲁米诺，鲁米诺经氧化后可发出蓝光。这种蓝光可经X光胶片曝光显影、荧光CCD扫描成像，或直接在弱光下肉眼观察。

(四)液相检测中的Fluorescein

技术应用：流式抗体标记(流式细胞术)、液相多因子检测技术(Luminex、BD-CBA等)

荧光素（Fluorescein，有别于luciferin）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋（allophycocyanin，APC）和花青素5（cyanidin 5，Cy5）等。

（五）核酸染料

溴化乙锭是一种高度灵敏的嵌入性荧光染色剂，为强致癌诱变剂，但价格便宜。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基可结合一个EB。EB的这种特性使其成为一种核酸染料，常用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。
GelRed和GelGreen 是两种集高灵敏、低毒性和超稳定性于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。
SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，主要用于实时荧光定量PCR（Q-PCR）。

（六）免疫荧光技术-抗原定位

技术目的：通过抗体识别抗原的免疫学原理，将荧光素(Fluorescein)固定在抗体上，无需酶催化，可直接根据荧光强度检测抗原含量以及分布。
核心原理：荧光强度—抗体含量—抗原丰度。
相关技术：Immunofluorescencetechnique
免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。