手持式PCR仪？科学家们又有新突破啦 聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA片段的技术，由诺贝尔化学奖得主KaryMullis于上世纪80年代发明，被誉为分子生物学领域的最重大进步之一，广泛应用于分子和遗传学分析。 30年以来，科学家们一直在试图优化PCR技术，并扩大它的用途。现在，来自于范德堡大学的科研团队提出一种新方法——“适应性PCR”（adaptive PCR），有望革新传统的PCR技术，并为“手持式PCR仪”带来可能。相关研究成果以“Adaptive PCR Based on Hybridization Sensing of Mirror-Image L-DNA”为题发表在《Analytical Chemistry》期刊。 1.5M微端,游戏极速下载 广告  广告详情 PCR 在讲解这一最新突破之前，我们先回顾下之前曾学习过的PCR反应。PCR反应有5个核心“原料”：DNA模板、引物（一段被设计用于与DNA模板互补的片段）、核苷酸碱基、DNA聚合酶以及缓冲液。 PCR的反应过程包含3个基本步骤，依次为：变性（高温环境下模板DNA发生变性，由双链变成单链）、退火（低温环境下引物与单链按碱基互补配对的原则结合）、延伸（温度回升至最适宜后，DNA聚合酶开始合成互补链）。至此获得两条精确复制地DNA双链。随后，PCR反应将进入“变性—退火—延伸”的循环，获得更多的半保留复制链，30-40个循环可以获得几百万倍的基因数量。 由此可见，温度和样本是实现PCR的关键因素。基于聚合酶制造的PCR仪实际上是一个温控设备，需要控制变性、复性和延伸的温度。室温的变化、样本化学成分的改变都会影响PCR反应。所以，实验人员可能需要经过多次试验优化出最佳的样本配比、最高效的温度设置。 适应性PCR 尽管技术成熟，PCR仪器却操作复杂且对样本的化学成分及反应环境高度敏感，这主要是因为没有最直接的方法从分子水平监控反应过程。 为了实现精准控制，范德堡大学的生物医学工程师Nicholas Adams和Frederick Haselton将“开箱即用”的理念应用于PCR，并提出“适应性PCR”（adaptive PCR）的新方法。他们利用左旋DNA（L-DNA）监测、控制PCR反应。 左旋DNA是DNA分子的镜像，其物理特性与右旋DNA一样，但是它不参与大多数生物反应。因此，当带有荧光标记的左旋DNA被添加至PCR样本中，它会以相同的方式（变性、退火）提供荧光信号反映分子反应信息、 为了验证他们的设想，Adams 和Haselton联合物理系助理教授William Gabella一起创建了一个适应性PCR设备原型（如下图），并进行相关验证试验。  手持式PCR仪：左边是紫外激光器，由它照射中间的样本，右边的分光光度计负责检测样本中荧光水平的变化，从而控制DNA复制过程。 Adams表示：“现有的PCR仪器非常挑剔。我们实验室配备有3台PCR仪。当我们将相同的样本放入3台仪器中，只有两台仪器正常工作。当我与仪器公司的技术人员反映这一问题时，她询问我仪器周围是否有八英尺厚的墙壁？我回复说是的。她解释是因为这堵墙干扰了气流，从而对仪器运行造成影响。当然，事实证明她是对的，因为当我把仪器移出来，它又开始正常工作了！” 技术人员对一系列可能的问题提出应对之策：仪器需放置在温度可控的房间；DNA样本需要纯化……即便如此，它仍然需要实验人员耗费时间优化反应条件。 现在，适应性方法能够控制PCR过程，有望简化操作、提高准确性、降低其对环境的敏感性，减少仪器大小（从台式到手持）。 适应性PCR的原理 适应性PCR借助荧光标记的左旋DNA确定理想的变性和退火温度，从而规避了所有变量。 左旋DNA序列可以通过商业合成获得，其序列与需要扩增的DNA序列一样，而且左旋DNA的两条链上分别标记上一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团（当两条链完整时，淬灭基团会吸收报告基团发出的荧光信号）。 伴随着高温环境，左旋DNA也会发生变性变成单链，使得荧光报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过分析荧光信号的累积速度，研究人员可以确定所有双链分离的精确时间点。 同时，我们还需要合成左旋引物（标记有荧光淬灭基团）。当PCR反应进行至退火步骤，引物会与左旋DNA单链集合，其淬灭基团会抑制荧光信号。这时候，荧光信号又会发生变化，从而便于研究人员分析引物与所有DNA单链结合的时间点。 值得注意的是，左旋DNA的量并不会改变，因为它不参与扩增步骤。 研究人员表示，这一适应性PCR技术可以弥补传统PCR仪器的局限性，它可以让基于PCR的诊断有机会脱离实验室环境，例如样本制备的高标准、反应温度的严密控制。 参考资料： DNA duplicator small enough to hold in your hand |
|
|
