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从果皮中提取和纯化RNA，用了专门针对多糖多酚含量高的植物的提取试剂盒，可是最后一步溶解RNA的时候还是特别不好溶，跑胶发现孔里很亮，应该是有多糖杂质，或者蛋白，或者别的，或者都有……心碎了一地。
用TRIZOL法一直没有结果？TRIZOL法是无法去除糖、酚类物质的。别急，今天技术咖分享一个实验方法。
0.75mol/L 柠檬酸钠，pH 7.0（含柠檬酸）。用0.1% DEPC处理并高压灭菌。
10%（w/v）N-月桂肌氨酸（N-lauroyl sarcosine）。
硫氰酸胍缓冲液：用293 ml无菌去离子水，17.6ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠，26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于65℃溶解250g 硫氰酸胍（不用称重）。
抽提缓冲液：每5ml 硫氰酸胍缓冲液加36µl 巯基乙醇。若被提取组织含多聚苯酚，抽提缓冲液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidone）（20% w/w）。
氯仿/异戊醇49：1（v/v）。
2 mol/L 醋酸钠，加乙酸至pH 4.0 。
酸性苯酚：500g 晶体苯酚溶于500ml去离子水中，50ml每份于－20℃保存，4℃可保存一个月。
异丙醇。
70%和100%乙醇。
2 mol/L 醋酸钾，加冰醋酸至pH 4.8。
1O mol/L LiC1。
TNE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1，pH 7.5，室温，150mmol/L NaC1，1 mmol/L EDTA。
TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1，pH 7.5，1mmol/L EDTA。
研钵和研杵。
液氮。
离心机。
玻璃Pasteur 吸量管，200℃干烤至少3小时。
在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻。
在研磨过程中，加入3.5ml抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管。用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。
23000g，4℃，离心20 分钟。
用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入10ml 聚丙烯管。
加0.4ml 2mol/L 醋酸钠，混合混匀。加4ml苯酚，混匀。加0.8ml氯仿/异戊醇，混匀。
聚丙烯管置于冰上 15 分钟。
离心，方法如步骤3。
用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml 聚丙烯管，加入同样容积的 2mol/L 醋酸钾，混合混匀。
聚丙烯管置于冰上至少30分钟。
44000g，4℃离心20分钟。
将上清液移入15ml聚丙烯管，加0.6-1 倍体积的100%的冰异丙醇，混匀，-20℃放置45 分钟。
以2700g，于4℃离心20 分钟。
轻轻倒出上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，如步骤12离心3 分钟，尽可能将乙醇倒净。
加入400µl DEPC 处理的水溶解沉淀，移至1.5ml管中。
加100µl 10mol/L LiC1，4℃ 放置至少2h。
12000g，4℃离心20分钟 。
用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
加入200µl TNE 重悬沉淀，再加500µl 100% 乙醇，-20℃ 放置至少15 分钟。
如步骤16离心5分钟 。
用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
加入200-400µl TE 重悬沉淀。
将每个样本稀释30-50倍，在 230nm，260nm，280nm测量吸光度。
开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀（若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层。
当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约4 ml，若因沉淀多而使体积明显不足时，用抽提缓冲液补足。
加入乙酸钾后，延长孵育时间（达30分钟）会提高 RNA 的质量，尤其出现蛋白污染时。多糖形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量高，延长孵育时间（至60分钟）也有助于沉淀更多的多糖。
加入异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀表明大量多糖的存在。孵育时间大于60 分钟，就会形成多糖沉淀。
RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于200µl TE，加1倍体积的2mol/L 醋酸钾，冰上孵育30分钟。12,000g ，4℃离心 20 分钟。将上清液移至一新1.5ml 管中，用2.5 倍体积的100% 乙醇沉淀RNA，-20℃，15 分钟。继续方法中的步骤16。
判断RNA分离的成功与否，测量在230，260，280nm处的紫外吸收可以评估RNA的产量和质量。若A260／230值小于2，则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260:A280比值小于1.7，表明蛋白污染。在琼脂糖凝胶上出现的28S和18S rRNA，可用以评估RNA的完整性。
该方法提取的RNA适于poly(A)＋的分离，Northern 分析，cDNA 分析，RT-PCR扩增。
以上实验步骤仅供大家参考，希望对你有所帮助。
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