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背景介绍 在过去十年中，高通量测序技术的进步对临床基因检测产生了相当大的影响，遗传检测在儿科医学中的作用得到越来越多的认可和扩展，而非遗传学专科医生通常下单检测其患者。由于遗传异质表型，目前的检测通常包括染色体微阵列分析（CMA）以检测拷贝数变异（CNV）和靶向测序包以检测单核苷酸变异（SNV）和小插入和缺失（indels）。这些常规的逐步策略（比如先检测芯片，阴性结果再靶向测序）可能是昂贵的并且耗时，然而对于大多数疾病组来说，它们仅在少数患者中明确遗传致病基因。临床表型驱动的策略可能使临床医生只愿意订购相关基因的小panel，然后小panel可能遗漏掉鉴别诊断的相关基因。全外显子测序显著增加了疑似遗传性疾病患者的临床诊断率。然而，前瞻性研究很少，WES可能会错过导致疾病的基因组变异的部分类型和区域（例如，indels，结构变异，内含子 SNV）。
与WES不同，全基因组测序（WGS）提供了单次测试的潜力，捕获几乎所有的基因组变异。越来越多的证据证明其在临床诊断中和发现新的遗传致病基因的价值。许多猜测集中在相对于靶向测试的全基因组测试的诊断优势和局限性。临床医生对WGS进行检测的可行性持怀疑态度，其部分原因是临床分析方法的可扩展性，预期的诊断阳性率和与标准化靶向测试相比，测试灵敏度仍然没有得到答案。“儿童医院基因组诊所”（加拿大安大略省多伦多市）包括纵向多方面的研究项目，其中就有将WGS纳入主流儿科诊断的课题。在我们的初步研究中，由临床遗传学家对符合CMA标准的患者队列下单，我们证据表明WGS对常规遗传学检测具有诊断优势。在这里，我们报告具有不同表型的103个新病人，比较WGS和NGS基因包的诊断率。 材料与方法 在2年（2013年4月至2015年6月）期间，我们从“儿童医院”（加拿大多伦多）的儿科亚专科诊所招募了不满18岁的无血缘关系患者。作为我们以前研究的补充，从临床遗传学诊所以外有意招募了大约相同数目的参与者。 没有明确分子遗传诊断的患者入选需要符合以下标准： 1. 他们正在SICK儿童医院的一个亚专科门诊诊所接受治疗； 2. 他们的疾病在临床上得到了很好的表征描述，并被认为是遗传异质性的； 3. 招募标准是要求进行基因检测以协助诊断和疾病管理； 4. 临床基因检测涉及多个基因的检测； 5. 现有的多基因检测具有不完全的敏感性； 我们还要求患者父母双方都可以进行测试，由于同意过程的复杂性，他们需要会流利的英语。 表型分析和常规分子诊断测试 从电子病历中提取表型数据，并输入PhenoTips（http://www.），表型信息在PhenoTips中使用人类表型本体（HPO）表示（游侠提示：国内的医生朋友可以参考www.chinahpo.org）。有关临床医生订购的常规分子遗传检测数据（当时可用的相关成本（美元））也从电子病历中提取。按照实验设计，所有个体都进行了靶向基因测序。还有一部分患者（43％）也进行了CMA测试。化学测试（血液和尿液），酶学研究，肌肉活检和医学成像等辅助性研究，在成本分析中未考虑。 全基因组测序（WGS） 采用illumina 150bp双端测序。
变异分析与注释 Isaac Genome Alignment Software进行比对，Starling (Isaac Variant Caller; version 2.1.4.2)进行call vcf，ANNOVAR进行注释，线粒体DNA采用MitImpact19进行注释， ERDS (Estimation by Read Depth with Single-Nucleotide Variants) 和CNVnator分析CNV变异。 结果  共有103名患者入组实验。这些患者中基因检测次数的中位数是3次，检测基因的数目中位数是19，绝大部分都是二代测序的基因包，共涉及1226个基因。最多的基因检测项目是基因芯片检测（n=44）。 常规基因检测方法的诊断率 共有25名（24%）患者通过常规基因检测方法获得了明确分子诊断。25名中还包括3名部分诊断的患者（临床医生可能会继续进行遗传检测来解释其其他临床表型）。 WGS技术参数 平均测序深度为37X，10X以上区域达到98%，20X以上区域达到93%，每个人平均携带390万个点突变与indel，17个罕见的CNV变异。另外还特地看了传统分子诊断的1226个靶向基因的外显子区，平均测序深度40X，绝大部分都是大于10X的，说明WGS的灵敏度很高。 WGS诊断率 有41名患者通过WGS获得了明确的分子诊断，与常规基因检测手段相比，显著提高了诊断率（P<>。17名只有WGS才能诊断的患者如表2（表文字太多，游侠就不贴了，感兴趣的自己看原文），其中case36有两个致病基因才能解释其临床表型。之前常规分子诊断的位点，包括线粒体突变，CNV变异，被WGS全部检测到（游侠：这就是WGS的强大之处）。 WGS诊断的病例分析 表2中的外显子区域的变异，是由于这些基因没有被常规的基因包所覆盖，一些原因是该基因是新发现的致病基因，另外一些原因是基因包覆盖的基因不够多，例如案例64，提示了的线粒体复合体II存在功能缺陷，在早期对线粒体疾病进行了广泛的生物化学和遗传学检测，然而，他最终被发现在PIGG基因上有一个致病突变，这是内质网基因，之前可能不会被考虑用于临床检测。
这项研究的结果为几种新发现的疾病致病基因提供了有价值的验证，包括PIGG，RNU4ATAC，TRIO和UNC13A。在两名参与者（病例3和45）中，先前发表的实验证据的深部内含子变异的致病性用WGS鉴定而被常规测序遗漏。病例5是由于小RNA基因RNU4ATAC发生了复合杂合突变，这个基因被市面上的绝大部分全外显子捕获试剂遗漏了。病例11是由于SLC25A19基因一个点突变和一个4.5KB的缺失，需要说明的是这样的小缺失通过常规的基因芯片是检测不到的。 全外显子测序与全基因组测序的比较 为了比较全外显子测序与全基因组测序的诊断阳性率，70名参与者同时进行了ION proton平台的全外显子测序，平均测序深度大于100X，在这部分参与者中最终有35名获得最终明确的分子诊断，其中有9名患者通过WES未检测到致病突变，而被WGS检测到。这些被遗漏的位点包括内含子深度的SNV、小的CNV、非编码区的SNV、线粒体变异以及外显子覆盖低的SNV（其他捕获厂家这些区域可能不存在这个问题）。 讨论 本研究提供了将WGS纳入怀疑遗传性疾病儿童临床处理的一些证据。此外，这些前瞻性数据支持涉及早期利用全基因组分析的测试策略。使用既定的临床分析流程，WGS提高了总体遗传诊断率，同时还检测了常规检测策略所鉴定的所有疾病变异。对于许多患者，由于WGS的早期使用，可以缩短由可量化（例如时间，遗传检测的费用）和无法量化的负担组成的难诊断引起的苦恼。 WGS在临床实践中的应用 如上所述，归因于WGS的许多新诊断是与传统测试相比具有特定技术优势的结果。额外的优点是可以定期系统地重新注释基因组范围的变体。对于这个队列中的一些未明确诊断的个体，我们预计在未来2-3年内将确定致病突变，而不需要再进行额外的基因检测。每次发现新的候选基因，针对新单基因检测或重复基因组检测是效率低下，耗时且费用昂贵的。也可以挖掘WGS数据用于医学上重要的药物基因组变异和意外发现位点。 WGS诊断率高于WES WES已经成为临床上强大的遗传病诊断工具，然而，与靶向测试相比，对临床WES的一个担忧是对于临床表型的关键候选基因的一些外显子的覆盖不足。而这对于WGS来说完全不是问题，因为WGS的均一性更好。随着时间的流逝，解读深度内含子和其他非编码的WGS变异的能力将得到改善，从而增加WGS对WES的诊断优势。因此，我们的预测是，WGS相对于WES的缺点，包括增加成本和增加数据分析和存储的需求，最终将被其诊断优势所代偿。 研究的局限性 虽然表型高度可变，但是从三个诊所来说，转诊是不成比例的。 例如，尽管绝大多数参与者具有神经表型，但只有三名来自神经科诊所的转介。另外，我们没有力量测试在这个异质研究人群中潜在影响诊断率的其他因素。本研究中WGS和WES均未进行临床验证测试，但所有诊断变异在返回给参与者之前已被临床证实。将基于研究的测试（WGS）与临床遗传测试进行比较，存在一些固有的挑战。具体包括成本，获取结果的时间和可伸缩性等。 未来方向 这些前瞻性数据为WGS如何转化儿科医学遗传评估提供了新的见解。随着临床WGS在更大范围内变得可行，最终可能成为一线诊断测试方法。通过将WGS数据的初始分析限制为特定基因和基因座，仍然可以进行临床表型驱动分析。进一步的大样本量研究将有助于描述这种方法的潜在优势和局限性。 本文翻译自pmid：28771251（回复数字，获得原文）
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