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二代测序技术即通过高通量基因测序技术实现对基因的精准读取， NGS不仅可以辅助对复杂疾病进行精准分型，还可以实现对遗传病的早期确诊。随着NGS的飞速发展，临床中应用NGS技术辅助疾病诊断的情况越来越多,通过临床应用使得全球最新的科研成果能够向临床转化，提高医生的诊治水平。不仅有NGS的试剂盒获得CFDA批准，同时业内关于NGS基因的解读指南也在不断完善，相关规范标准也在陆续出台。 目前NGS测序主要有三种类型：Panel测序、全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing，WES）、全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）。这三种类型各有优劣，在临床应用的时候如何选择能够益处最大化呢？这里，通过引用一篇关于NGS用于临床诊断的综述（发表于新英格兰医学期刊）来进行详细的产品解读。  Panel测序、WES、WGS概述 由于NGS通量远高于sanger测序方法，通常可一次性得到数以千计的变异信息。目前，Sanger测序虽然仍然是测序金标准，但从文中所述的684个样本的5个基因测序结果来看，NGS的验证率已达99.97%。NGS测序三种类型根据成本由低到高依次如下：Panel测序<WES<WGS；Panel测序，针对临床的疾病归类，是对一组相关基因开展的检测，主要包括基因的外显子区域，还可以涵盖一些特殊的区域，如根据致病位点增加的内含子、启动子等区域；WES是对所有已知基因的外显子区域进行捕获测序；WGS是对整个基因组进行测序，既包含基因全长，也包括了基因间区域。 以上三种测序均有其局限性，Panel测序由于针对性强，检测范围较窄，仅适用于疾病类型较为明确的情况；全外显子组测序可以对基因的外显子区域进行检测，但存在调控区域（内含子、基因间区等）、内含子区域的致病位点漏检的情况；全基因组测序则因为测序和数据管理成本远高于前两者，所以在临床应用中并非是首选。而且，测序数据的分析难度由低到高依次如下：Panel测序<WES<WGS。另外，文中指出，每种实验类型都有一个相关的假阴性结果模式。例如，panel测序可能不包括某些突变基因，WES可能遗漏深度内含子的剪接突变。另外，基因组的某些区域难以用任何现有方法进行测序。所以根据临床测序目的，可以相应地选择Panel测序或全外显子组测序。  图 临床新一代测序(NGS)测试类型 鉴于NGS测序最终目的是获得诊断，那么如何选择对应的测试策略呢？ 在遗传背景清楚的情况下，基因panel通常有比WES、WGS更高的诊断率，因为它的测序深度更高，敏感度和特异性更好。在一项遗传性视网膜疾病的222基因panel筛查中，诊断率可达55%。根据不同情况，Panel测序靶向与特定临床表型相关的几组基因，表型范围可能很窄（如家族性高胆固醇血症检测组合中的4个基因），也可能很广（如智力障碍检测组合中超过1,000个基因），基因panel的成本根据基因数的多少而改变。但是文献还指出，单纯地增加panel的基因数，诊断率并不能呈线性增加。 迈基诺推出的Panel测序产品的优势明显，如下： （1）测序深度保证：针对各个系统独立设计捕获探针，并覆盖了HGMD报道的致病的内含子捕获区域，测序数据质量更高，平均深度可达300X以上； （2）全面覆盖：检测范围不仅包括基因的全部外显子区域，还包括HGMD中报道的已知的基因深度内含子的致病突变。可一次性检测点突变及拷贝数变异，同时满足临床和科研需求； （3）更新优化：定期优化、更新捕获探针，及时增加最新报道疾病相关基因，自主性更强  此外，在遗传背景不确定或涉及多系统复杂临床症状的情况下，WES诊断率可能更高；在临床中，WGS和WES可用于基因panel诊断为阴性的患者；文献指出WGS和WES的诊断率可达25%-52%，远超其它诊断工具，例如全基因组芯片（Chromosome Microarray Analysis，CMA）。同时，对于高质量WES测序区域获得的不一致结果，WES数据正确的可能性高于Sanger测序数据。目前，已有越来越多的证据支持NGS测序所提供的快速诊断可影响医疗管理，并通过减少尝试性治疗以节约成本，可节省医疗资源：在2项WES新生儿筛查项目中，诊断率分别为52%和51%，影响了25%和72%的临床治疗策略（注：25%的这个研究是平均6岁，72%的是平均33天。显然越早做测序诊断越好）。一项研究中，6名患者由于测序获得诊断，而带来医疗管理的改变，预计节省1-2百万美元。这提示未来基因组数据将影响医疗决策，并且适用的患者多样且不断增长。 迈基诺推出的全外显子测序产品的明显优势如下： （1）特殊优化探针设计：全面覆盖人类基因组的外显子区域，及HGMD报道的内含子，基因间区域致病位点（涉及3086个基因，11101个位点）；对常见缺失重复的50个基因局部增加探针密度；针对特殊区域根据GC含量和Tm值调整探针密度和长度，捕获效率更高，CNV分析更准确； （2）最新数据库：基于2018年最新版数据库（RefSeq , GENCODE , CCDS , UCSC , HGMD专业版），并加入迈基诺7万多例临床疾病数据库（MutInDatabase）独立设计捕获探针； （3）探针属性：基于迈基诺自主研发GenCap®专利基因捕获技术，利用双链DNA探针进行捕获测序，较市场中RNA探针和单链DNA探针的同类产品，提高了捕获效率，捕获稳定性，均一性； （4）高性价比：相较于全基因组测序性价比高（避免大量冗余数据、测序成本降低）。  基因测序临床应用重视点 文献指出在基因测序临床应用中还需要重视几点，同样也是迈基诺基因测序产品非常重视： （1）在制定NGS测试策略时，需要考虑检测的局限性、基因panel的设计、成本、纳入已知的任何致病基因变异； 迈基诺产品在设计时尽力纳入最全的基因，致力于提高产品性价比，同时全面覆盖人类基因组的外显子区域，及HGMD报道的内含子，基因间区域致病位点，为客户需求考虑全面。 （2）当先证者父母一起参与测试时，三人测试（trio testing）可增加16%的诊断率； 迈基诺推出了panel检测和全外显子检测trio产品专门针对一家三口，价格更划算。 （3）如表型直接相关变异未检出，次级发现（非与患者表型直接相关，但可致病，例如肿瘤相关基因BRCA1/2等）仍值得关注；同时临床意义不明（VUS）位点，可能是未知致病位点，需要注意。 迈基诺推出的panel检测和全外显子检测不仅都会在报告里体现直接相关的致病突变，同时也体现次级相关突变和意义未明突变，并结合ACMG指南进行标注。但是部分罕见疾病由于报道较少，可能出具报告时证据不足，这对于基因检测是挑战也是机遇。所以迈基诺在基于全球优秀的疾病数据库的基础上，也在不断致力于完善我们自有的知识库，希望能够为医生和患者提供最优质的服务。 未来发展方向 临床基因组和外显子组测序领域正在迅速发展，许多项目集中于提高诊断率。目前受关注的领域包括RNA检测的整合、结构变异的检测以及与检测方法（Panel、WES、WGS）相关的决策的改进。正在进行和计划中的基因组学和健康研究正在增进我们对基因组变异与疾病之间关系的了解。将临床NGS纳入常规医疗的未来临床计划可能预示着现有人类基因组和外显子组序列总数的大幅增加。费用、伦理学和标准方面的进展将有助于建立一条路线，通过这一路线将临床NGS和相关技术更广泛地纳入常规医疗实践中。考虑到过去5年的发展速度之快，所有医务人员都应该密切关注这一变革性领域发生的变化。 编辑：Dr.简 李晨 |
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