《hepatology》案例：深度剖析circRNA研究

肿瘤研究中，该怎么样进行circRNA研究，到底又能发表多大影响因子的文章，是大家都非常感兴趣的问题。通过这篇发表在《hepatology》上的肝癌circRNA研究，我们来窥探下，从样本准备到机制研究，到底该做些什么？

一．肿瘤特异性的circRNA筛选

a.肿瘤研究，用什么样本去筛选呢？

癌和癌旁样本是本研究的选择，因为可以直接反应病灶细胞中的的异常分子（癌和正常组织也可以考虑）。

b.多少的生物学重复比较合适？

本研究用了7个癌和7个配对癌旁的样本进行circRNA芯片筛选（circRNA芯片，咨询shbio.com）。理论上来说，重复越多越好，本研究7个，是性价比比较高的选择。

c.选择多少差异进行qRT-PCR验证？

一般情况下，高通量筛选后，差异circRNA数量从几十，到几百，几千都有可能，本研究对上调和下调最显著的分别10个circRNA进行了验证。

d.验证样本选择多少比较合适？

芯片用了7对样本，验证肯定需要扩大样本，本研究共通过21对样本进行了确认，最后只有6个circRNA能和芯片吻合（6/20的吻合率，应该来说在circRNA领域是一个比较平均的吻合率）。当然，在有样本的情况下，只有21对还是不够的。本研究还对261对样本进行了验证，结果其中的一个circRNA在87.4%的样本中得到验证。

二．候选深入研究的circRNA

怎么找到候选研究circRNA？

上面的验证结果有6个符合芯片结果，那么，怎么进一步缩小范围？本研究把其中的4个在HCC组织中下调的circRNA，都在细胞系中进行了沉默，看哪个能有表型。结果显示，只有circMTO1能促进HCC细胞增殖。因此，circMTO1是后续研究的对象了（异位表达，有表型才是王道）。

三．circRNA与临床指标关联

circRNA的异常表达和临床表现有什么关联？

这个是肿瘤研究不可回避的问题，找到关联，才能有临床意义。因此，该研究对116对HCC的生存数据与circMTO1的表达用ISH组织芯片进行了分析。结果显示，低的circMTO1表达与不良预后有关。因此，circMTO1可能是一个作为HCC预后诊断的指标。

四．circRNA机制研究

circRNA作用机制多样，其中，ceRNA机制是大家很容易想到的机制，那么，circMTO1是否通过ceRNA机制发挥功能呢？

a. circRNA结合的miRNA怎么找？

首先，可以通过分析预测可能结合的miRNA

该研究通过MiRanda预测，发现有99个miRNA都可以结合circMTO1。

其次，通过调研目前在HCC中发现的miRNA，发现只有20个是和HCC相关（这一步很重要）。

最后，通过实验的手段确认目标。通过RIP实验，研究人员在20个miRNA中，确认miR-9是能和circMTO1结合的。值得注意的是，在HCC中，miR-9通常是高表达，也和病人不良预后相关。这样，就找到了circMTO1潜在的ceRNA机制靶分子miR-9。

b. ceRNA机制研究要什么做？

来证明ceRNA调控机制，有很多工作要做。

第一步，circMTO1和miR-9是否共定位？

两者相互作用，必定会共定位，且会在细胞质中。基于这个思路，该研究进行了细胞定位分析。确实，circMTO和miR-9共定位于胞质，且在肿瘤组织中相比癌旁少。

第二步，circMTO1是否与miR-9相关调控肿瘤过程？

要解释这个问题，先要在细胞中干预表达circMTO1。当然，要做干预表达（过表达，沉默）也有讲究，用什么细胞做？

该研究先检测了8个不同HCC细胞系，找到最高表达circMTO1,低表达miR-9细胞系HepG2 和SMMC-7721，最低表达circMTO1，高表达miR09细胞系SK-Hep1 和 QGY-7701。接下来就好做了，细胞中低表达的进行过表达cirMTO1，高表达的进行siRNA沉默。然后去观察细胞表型变化。

结果显示，circMTO1沉默导致细胞增殖增强，细胞侵袭变强，较少细胞凋亡；过表达得到相反的结果。同时，在沉默细胞中过表达miR-9加强促瘤表型。因此，这就把circMTO1和miR-9的功能也联系起来了。

第三步，circMTO1吸附miR-9，影响了下游哪个基因？

ceRNA机制的核心是circRNA-miRNA-mRNA，找到了前两个，第三个怎么找呢？

因为前面找到miR-9已经在HCC中有研究了，那么靶基因自然而然就出来了。已经研究表明，肿瘤抑制基因p21是miR-9靶基因（现在终于明白为什么当初找miRNA时需要动动脑筋了）。

第四步，circMTO1-miR-9-p21，怎么走？

HCC细胞中沉默circMTO1或者转染miR-9 mimic，检测p21的mRNA和蛋白表达。非常理想，p21 mRNA水平和蛋白表达都降低了。而过表达circMTO1时，p21 mRNA水平和蛋白表达都升高了。这样就基本可以确定，circMTO1通过下调miR-9而保护了p21被降解的命运。

当然，到了这一步，还可以通过其他的途径来进行佐证。研究人员在circMTO1沉默后，用miR-9 inhibitor降低miR-9表达。结果非常明显，p21的mRNA水平和蛋白表达并没有显著降低，细胞增殖和凋亡表型也变弱。这样，circMTO1-miR-9-p21这条路完全走通了。

五．体外结果，体内验证

其实，上面的实验结果，基本已经把circMTO1的生物学功能说清楚了。当然，唯一的遗憾在于，这些结果都是用体外细胞实验做的。所以，接下来就是用裸鼠模型，通过体内实验在验证circMTO1在HCC中的作用。

通过在裸鼠中移植HCC组织，持续注射circMTO1 siRNA两周，发现肿瘤生长迅速，血清中AFP表达增加，p21表达减少，CDK2表达受抑制，细胞侵袭，增殖markers表达上调。因此，circMTO1确实是在HCC中抑制肿瘤发展过程。

是不是有一种非常熟悉的味道？从高通量筛选，到大样本验证，到后面的ceRNA机制研究，最后体内实验验证。该研究用一种非常熟悉的手段，验证了一个circRNA在HCC中的重要角色。虽然没有什么原创性的实验，但也不乏各种技巧在里面，你是否已经get到了？circRNA研究，确实难，也确实可以这么简单。