一份针对circRNA circMTO1在抑制肝细胞癌进展过程中的作用机制的研究

非编码RNA（Non-codingRNA）是指不编码蛋白质的RNA，其中包括长非编码RNA（longnon-coding RNA，lncRNA），微小RNA（microRNA，miRNA），和环状RNA（circularRNA，circRNA）等多种已知功能的RNA，其在癌症生物学中发挥重要作用，为癌症干预提供了潜在的靶点。其中，circRNA作为一类新型内源性非编码RNA，呈共价闭环结构，既不具有5'至3'极性也不具有多腺苷酸化尾部，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定，具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变。此外，部分circRNA分子含miRNA应答元件（miRNAresponse element，MRE），可充当竞争性内源RNA（ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。因此，circRNAs可以作为有效的miRNA海绵，与miRNA相互作用调控基因表达。

近年来，环状RNA被证实参与发育过程，调节细胞功能，心脏病的发病机制，以及神经退行性疾病的发展，如阿尔茨海默病。在肿瘤发生与进展的研究中，就像miRNA在癌症中的广泛参与一样，circRNAs作为一个新兴领域，其表达谱和在癌症发生与进展中的作用受到了广泛的关注。最近，某些种类的circRNAs被发现在胃癌、结直肠癌，食管鳞状上皮癌中明显失调，并且参与了癌症发展。这些观察结果表明circRNAs可能是一种新型的潜在生物标志物和治疗癌症的靶点；然而，阐明解除管制的circRNAs并确定它们的功能仍是癌症研究中一个正在进行的过程。在这里我们分享一篇关于circRNA在肝癌（HCC）组织中表达谱的研究分析：该研究中，通过对公共数据库中癌症相关数据的分析，在细胞水平和动物水平的发现探讨并验证了circRNAcircMTO1在HCC中的作用及其潜在机制。

该研究首先利用芯片GSE97332（7对样本）分析了circRNA在HCC中的表达情况，筛选出在HCC肿瘤组织中表达量上调或下调最多的10个circRNAs（图1A），并在不同HCC患者中确定其表达情况，筛选出在HCC肿瘤组织中表达一致且明显下调的circMTO1（图B）。与其他在HCC肿瘤组织中低表达的circRNAs相比，只有沉默circMTO1才能显著促进HCC细胞增殖。此外，Kaplan-Meier生存曲线提示HCC中circMTO1表达降低与患者预后不良相关，circMTO1表达最有效的截断值为76.89，可能对HCC患者的预后预测有效（图2）。

图1

图2

为了进一步研究circMTO1在HCC中可能的作用机制，该研究分析了与circMTO1相关的潜在miRNAs。利用RIPcircMTO1下拉实验，筛选miRanda数据库预测的circMTO1靶向miRNAs。结果发现与对照组相比，miR-9和circMTO1有特异性的富集（图3A-B）。荧光原位杂交（FISH）的分析结果表明，与癌旁组织相比，HCC肿瘤组织中circMTO1与miR-9在细胞质中的共定位有所降低（图3C）。以上结果证明circMTO1可以在细胞质中与miR-9结合。

图3

在体外成功构建了circMTO1沉默和过表达的HCC细胞模型，以研究circMTO1在HCC进展中的作用，及其与miR-9的相互作用（图4A）。细胞功能学相关实验结果表明下调circMTO1可显著促进肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的增殖（图4B）、侵袭（图4C），并抑制细胞凋亡（图4D），而上调circMTO1可促进肝癌细胞QGY-7701和SK-Hep1的凋亡（图4D）。此外，过表达miR-9与沉默circMTO1有相似的肿瘤促进作用（图4B-D）。

图4-1

图4-2

为了进一步探究circMTO1是否通过miR-9发挥其抗肿瘤效应，该作者检测了miR-9的靶向基因，肿瘤抑制因子p21的表达。如图4E-F所示，沉默circMTO1或转染miR-9 模拟物可显著降低肝癌细胞中p21的mRNA和蛋白表达水平；过表达circMTO1则得到与之相反的结果。此外，miR-9抑制剂可以显著缓解circMTO1沉默导致p21mRNA和蛋白表达的下调（图5A-C）。更重要的是，miR-9抑制剂阻断了肝癌细胞中沉默circMTO1介导的促进增殖和抑制细胞凋亡（图5D-E）。这些数据表明，circMTO1作为miR-9的海绵抑制HCC进展，并通过circMTO1/miR-9/p21轴消除miR-9致癌效应。

图5

在体内实验中，连续在瘤内注射circMTO1siRNAs后，携带HCC的SMMC-LTNM裸鼠中肿瘤生长明显加快，血清AFP显著增加（图6A-B)。此外，SMMC-LTNM裸鼠肿瘤组织中circMTO1、p21和下游CDK2的表达显著降低，细胞侵袭和增殖标志物MMP2和PCNA上调（图6C-D）。因此，circMTO1可以在体内抑制HCC的进展。

图6

该研究为大家探索circRNA在肿瘤发生和发展中的ceRNA作用机制提供了一个很好的思路；并且为验证circRNA和miRNA之间的相互作用机制提供了一些切实有效的研究方法。

参考文献：DanHan, Jiangxue Li, Huamin Wang, Xiaoping Su, Jin Hou, Yan Gu, etal.. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 tosuppress hepatocellular carcinoma progression. Hepatology. 2017, doi: 10.1002/hep.29270.