曹雪涛院士Hepatology杂志发表环形RNA研究文章

1. CircMTO1是怎么找出来的？

文中作者利用环形RNA芯片分析法，在7对肝细胞癌（HCC）标本的癌组织和癌旁组织中筛选差异表达的环形RNA，汇总了表达增高和表达降低最明显的环形RNA各10个，然后在21例HCC标本中验证，其中有6种变化相对比较明显。

图1 HCC差异表达环形RNA及验证实验（来自[1]）

不难看出circMTO1是变化比较明显的一种环形RNA，但其他的环形RNA变化也比较明显，为什么还是选择探索circMTO1的变化呢？作者文章介绍了个中原委：首先，在进一步放大的标本量（261例HCC标本）中高达87.4%的标本表现为低表达。其次，在早期的预实验中发现，敲低circMTO1可明显促进细胞增殖，而其他的环形RNA（包括circARID1B、circFAM13B和circFARP2）的效果不明显。这些线索都暗示了circMTO1在HCC中的重要作用，因此作者将研究目标集中在circMTO1上就顺理成章的事情了。

图2 circMTO1在HCC病人标本中明显下调（来自[1]）

2. CircMTO1与HCC预后的关系

从上面的结果得知circMTO1在HCC病人中明显低表达，那么circMTO1的表达状态与HCC患者的预后指标关系怎样呢？作者集中分析了116例有生存数据的标本中circMTO1表达与HCC疾病预后指标的关系。基于组织原位杂交（ISH）检测，结果表明circMTO1在HCC病人中明显低表达。低表达的circMTO1对应于较差的HCC预后。这些数据不仅支持了芯片筛选和QPCR验证的结果，更凸显了circMTO1在HCC疾病中的重要意义。

图3 circMTO1表达与HCC病人预后指标的关系（来自[1]）

3. circMTO1竞争性结合miR-9

miRNA sponge功能模型是环形RNA报道最多的功能模型。作者也进行了这方面的机制研究。基于MiRanda Program预测，得到了99中可能竞争结合的miRNA，作者从中挑选了已报道的与HCC密切有关的20种miRNA进行下一步的筛选分析。为得到有力的竞争性结合miRNA证据，作者进行了相互作用miRNA的沉淀钓取实验：RNA in vivo precipitation (RIP)，通过收集细胞内相互作用的miRNA样品，再在上述的20种miRNA进行筛选，最终发现miR-9与circMTO1存在相互作用。该实验是基于生物素标记的探针与circMTO1的环化位点特异性结合，钓取与circMTO1相互作用的RNA分子进行验证的。

图4 RIP实验发现circMTO1与miR-9存在相互作用（来自[1]）

作者还进一步通过荧光原位杂交实验证明了circMTO1与miR-9存在共定位关系。

图5 荧光原位杂交证明circMTO1与miR-9共定位（来自[1]）

4. circMTO1与HCC的关系

为探索circMTO1和miR-9在HCC细胞中作用机制，作者首先在常见的HCC细胞中分析了circMTO1和miR-9的表达情况。SK-Hep1细胞中circMTO1表达最低而miR-9表达最高，QGY-7701细胞中两种RNA表达量均适中，HepG2和 SMMC-7721细胞中circMTO1表达最高而miR-9表达最低。因此作者选择在HepG2和 SMMC-7721细胞中进行circMTO1的干扰实验，在SK-Hep1和QGY-7701细胞中进行circMTO1过表达实验。作者也对所设计的circMTO1的干扰RNA特异性进行了鉴定，表明它们均只特异性降低circMTO1的表达，而不影响MTO1的线性RNA和另一种circMTO1剪切变体的表达量。

HepG2和SMMC-7721细胞中干扰circMTO1后明显促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡。而在SK-Hep1和QGY-7701细胞中过表达circMTO1抑制细胞增殖。miR-9表达量分析结果表明circMTO1并不直接影响miR-9的表达，说明circMTO1是通过竞争性结合miR-9抑制后者的致癌性作用的。P21是miR-9的一个重要靶标分子，进一步的实验表明circMTO1通过上调p21抑制HCC细胞增殖，侵袭和增强细胞凋亡。

图6 circMTO1通过上调p21抑制HCC细胞增殖，侵袭和增强细胞凋亡（来自[1]）

如果circMTO1是通过竞争性结合miR-9抑制后者对p21的抑制作用而发挥作用的，直接抑制miR-9应该也会有相似的结果。于是作者进行了miR-9抑制实验以验证这一假设。miR-9抑制剂能明显提高p21的表达。当敲低miR-9之后，再干扰circMTO1就不再影响肿瘤的增殖，迁移和凋亡状态。这些数据充分说明circMTO1的确是通过竞争性结合miR-9，影响后者的功能最终对HCC肿瘤发挥作用的。

图7 miR-9抑制剂可上调p21并可阻断circMTO1在肿瘤中的作用（来自[1]）

最后，作者还在肿瘤体内模型中验证了相关结论。通过向HCC裸鼠模型中持续两周注射胆固醇标记的circMTO1干扰RNA，大大促进了HCC模型中血液AFP（甲胎蛋白）的水平，并促进了肿瘤的增殖。也促进了p21的下游基因CDK2的表达。至此，整篇文章的故事就圆满结束了。

图8 circMTO1的肿瘤内沉默促进体内HCC的生长（来自[1]）

关于本文科学意义的思考

在其他微信号里，山人注意到一些同行发表了一些观点认为本文的故事不过如此，更可能是因为曹雪涛院士的影响力大才发表到这么好的杂志上的。山人不赞成这一观点，曹雪涛院士当然是蜚声海内外的著名科学家，但本文能发表在Hepatology杂志未必是简单的“名人效应”的结果，还是有不少可圈可点之处的：

首先，本文揭示的circMTO1在HCC中表达特征非常显著，且与肿瘤的预后相关性很强，具有非常重要的临床研究和应用价值。意义大价值高的东西更容易受到优秀杂志的青睐。

其次，本文提出的分子机制证据充分，论证严谨。本文发现的circMTO1竞争性结合miR-9的分子机制模型经过了反复的论证，RIP实验和FISH实验非常有力的支持了circMTO1竞争性结合miR-9的结论，后续在细胞和动物模型的实验也很好的支持了circMTO1通过竞争性结合miR-9发挥对肿瘤的影响的假设。本文所展示的实验结果严谨而有力，不拖泥带水，简洁明了而又强有力的论证了所提出的机制模型，在已发表的miRNA Sponge功能模型的文章中也是比较难得的。清晰有力的逻辑论证也是本文的一大亮点，这也是高水平杂志能认可该工作的一个重要原因。

通过本文的学习，山人也参悟到一个道理：清晰严谨的实验论证，重要的科研和应用价值都是所开展的研究工作能否受到知名杂志青睐的非常重要的前提条件。

参考文献：