看曹雪涛院士如何做circRNA的研究！

肝细胞癌HCC是人类常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤发病率排在第五位。由于早期诊断困难和对各种治疗反应差，肝细胞癌的5年死亡率仍较高。尽管近年在肝癌的早期诊断和肝癌治疗等方面的研究取得了很大的进展，肝癌的治疗手段仍然是有限的。非编码RNA在癌症生物学中起到重要的作用，提供潜在的肝癌治疗靶点。一些内源性的非编码RNA如circRNA『注：王泽峰的文章证实circRNA是可以编码蛋白的，《》』，在发育、细胞功能和特定的病理学应答中起到重要作用，特别是circRNA可以作为microRNA海绵来调控基因表达『注：即circRNA的ceRNA机制：《》』。研究失调的circRNA和它们在癌症中的功能引起越来越多的重视。

近日，肝脏领域顶尖杂志Hepatology『IF=13.246』在线发表了题为“Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression”的文章，其中中科院院士曹雪涛和第二军医大学于益艺教授为通讯作者。

正文解读

为了研究circRNA在肝细胞癌HCC组织中的表达情况，作者使用circRNA microArray分析了7对HCC组织样本（7例HCC组织及其7对相应的正常组织作为对照），然后分别筛选出了在HCC组织中上调最多或者下调最多的10个circRNAs（Fig. 1A）。

好了，“海选”结束，开始初赛！于是作者又在来源于21个病人的HCC样本中对上述20个circRNAs的表达情况进行了验证，其中Fig. 1B展示了其中6个的表达情况。结果发现就circMTO1水平发挥稳定前后表现一致，于是我们的曹院士就翻了它的牌~~o(>_<)o ~~。所以本文就研究它了！

接下来作者又放大了样本量来继续考验circMTO1的表达情况，结果不负众望，在261例HCC组织样本中有228例（87.4%）明显下调了（Fig. 2A&B），嗯，表现还是不错滴！

尽管circARID1B, circFAM13B, 和circFARP2在HCC样本中也有下调，但是初步结果显示，沉默这些circRNAs对HCC细胞的生长没有明显的影响，而只有沉默circMTO1时才会明显促进HCC细胞的增殖。于是曹院士更加坚定了只翻circMTO1牌子的决心！

因为上述实验表明circMTO1在HCC组织中有明显的下调，所以作者接下来研究了circMTO1是否与HCC病人的预后相关。作者通过组织原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）分析了116例带有生存数据的样本，结果发现，与正常组织相比，circMTO1在HCC组织中也明显降低了（Fig. 2C）。更重要的是，HCC组织中circMTO1表达越低，HCC病人的预后越差（Fig. 2D&E）。

以上结果表明circMTO1表达的降低与病人较差的预后相关。

因为circRNA主要是作为miRNA的sponge『吸附可以起功能的miRNAs来调控相应基因的表达』来起作用，所以作者接下来又试图找到可以与circMTO1结合的miRNAs。通过miRnada（不知道这个数据库的点击这个：《》）预测软件海选出了99个可能会与circMTO1结合的miRNAs。为了确定到底是哪些miRNAs可以与circMTO1结合，作者又使用circMTO1特异性的探针进行了RIP（RNA in vivo precipitation）实验对上述99个miRNAs进行筛选。作者主要分析了之前就报道的20个可以在HCC中起作用的miRNAs（miR-204, miR-760, miR-4476, miR-6876, miR-152, miR-3686, miR-3159, miR-199a, miR181a-2, miR-211, miR-218-2, miR-3155a, miR-6730, miR-15a, miR-199b, miR-223, miR-3156, miR-4286, miR-4302, miR-9），结果发现miR-9有明显的富集（Fig. 3A&B），而其他miRNAs则没有明显的富集，于是确定了miR-9为circMTO1的结合miRNA（circMTO1终于选好媳妇了~）。

通过FISH实验发现circMTO1确实可以与miR-9在胞质中共定位，不过与对照组相比，HCC样本中的共定位明显减少（Fig. 3C）。这表明circMTO1确实可以与miR-9在胞质中结合。

接下来研究了circMTO1与HCC进展的关系。为了选择用来沉默或者过表达circMTO1的细胞系，作者检测了8个细胞系中circMTO1和miR-9的表达情况，结果发现，SK-Hep1相比中circMTO1表达最低，miR-9表达最高，QGY-7701细胞中两种RNA的表达都适中， HepG2和SMMC-7721细胞中的circMTO1表达较高，而miR-9的表达较低（Fig. S3A）。于是作者选择了在HepG2和SMMC-7721细胞中敲减circMTO1，而在SK-Hep1和QGY-7701细胞中过表达circMTO1。作者在circMTO1的接口处设计了siRNA，在HepG2和SMMC-7721细胞中转入siRNA后通过qPCR进行了检测（Fig. S3B）。为了说明这个siRNA对其他circMTO1的变体或者线性的MTO1没有影响，也对这些基因进行了qPCR检测（Fig. S3C）。结果发现这个siRNA的特异性很好。另外还构建了circMTO1的过表达系统，在SK-Hep1和QGY-7701细胞中检测发现可以有效过表达circMTO1（Fig. S3D）。

作者在HCC细胞中沉默circMTO1来研究其对HCC进展的影响以及与miR-9的相互作用（Fig. 4A）。在HepG2和SMMC-7721细胞中沉默circMTO1明显促进了细胞增殖（Fig. 4B），增强了细胞的侵袭（Fig. 4C），并且减少了凋亡（Fig. 4D）。而在SK-Hep1和QGY-7701细胞中过表达circMTO1则明显促进了细胞的凋亡（Fig. 4D）。另外在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达miR-9与沉默circMTO1效果相似（Fig. 4B-D）。

另外作者还检测了circMTO1的sponge功能，结果发现过表达和沉默circMTO1都不会影响miR-9的表达水平（Fig. S4A&B）。这说明circMTO1是通过sponge来抑制miR-9的功能的。

为了进一步证实circMTO1是否是通过sponge吸附miR-9来发挥抗肿瘤的作用的，作则又检测了肿瘤抑制基因p21的表达情况，另外p21也是miR-9的靶基因（Fig. 4E&F），无论是沉默circMTO1还是转入miR-9的mimics，在HCC细胞中都可以明显减少p21的mRNA和蛋白水平。另外过表达circMTO1则可以增加p21的mRNA和蛋白水平。这说明circMTO1可能是通过防止p21被miR-9下调来行使其抗肿瘤作用的。

接下来的也是经典实验，rescue实验！既然沉默circMTO1会释放部分miR-9出来起作用，那么加入miR-9的inhibitor是不是由沉默circMTO1引起的变化又不起作用了呢？另外一个方向的rescue也可以过表达circMTO1的同时过表达mir-9，如果加上这个实验会更完美，不过可能由于circRNA表达效率和miRNA表达效率相差会比较大，表型不会那么明显，所以作者也没做这个实验。由Fig. 5A-C可以看出，当加入miR-9的inhibitor时，p21的mRNA和蛋白水平都不再被下调了，另外circMTO1沉默也不再促进细胞增殖和抑制细胞凋亡了（Fig. 5D&E）。

以上数据足以表明，circMTO1是通过作为miR-9的sponge来抑制HCC进展的，另外是通过circMTO1/miR-9/p21信号轴来消除miR-9的致癌作用的。

要想提升文章档次，体内实验必不可少！所以作者又建立了一个HCC的裸鼠模型（SMMC-LTNM），然后通过尾静脉注射了circMTO1的siRNAs，两周之后发现，肿瘤生长加速了，血清中AFP的水平明显增加了（Fig. 6A&B）。尾静脉注射siRNAs48h后SMMC-LTNM的肿瘤组织中circMTO1和p21的表达水平就明显减少了（Fig. 6C）。另外，内源性敲低circMTO1也会抑制p21及其下游CDK2的表达，而细胞侵袭和增殖的marker MMP2和PCNA则上调了（Fig. 6D）。这些数据表明circMTO1可以在体内抑制HCC的进展。

思路总结

本文思路如下：

1. 从临床样本出发，通过高通量芯片筛选结合qPCR验证得到感兴趣的circRNA；

2. 放大临床样本量确认该circRNA具有普遍性，这样研究该circRNA才有意义；

3. 以circRNA的ceRNA机制为基础展开研究。首先筛选得到circRNA结合的miRNA，然后检测其下游靶基因，并结合rescue等实验对该机制进行更深入准确的研究；

4. 体内验证。

相信经常读科研小助手文章的童鞋都会有似曾相识的赶脚，其实这就是类似于miRNA的研究思路。只不过机制不同而已。当然按照此套路做下来我们未必能发到hepatology上，人家毕竟是曹院士么！不过3-5分还是没有压力的！做circRNA的都可以参考本文设计实验。

1 Han D, Li J, Wang H et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression. Hepatology 2017.

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