细说酶活性测定的底物耗尽

前    言

关于日立生化分析仪，想必检验科的各位老师都不陌生，自90年代初进入中国以来，有许多大家熟悉的机型，例如单机最快的7180、模块组合式的7600，还有7020、7170、7150、LST003、LST008以及最新的3100、LST008AS，今年还在日本最新上市了五合一型的3500多功能型自动化设备。

日立公司一直以技术为主导，致力于提供更加准确地数据。我们采用世界独一无二的凹面蚀刻光栅，保证分光的准确；专利技术的高耐磨陶瓷材料制成的吸样注射器，配合先进的数字步进马达，保证加样的准确；循环恒温水浴技术，保证反应体系的恒定。

同时，为了保证数据的准确可靠，软件系统除使用方便之外，还兼顾着许多非常重要的功能，例如数据的报警，它可以进一步帮助我们更好地判断数据的可靠性。

本周为大家介绍关于酶类项目底物耗尽限的内容。

案    例

数天前，有用户问：一患者的ALT结果是-1u/L，但是既往结果（3天前）却是1574u/L，临床诊断是肝硬化。在了解情况后，得知结果重复性很好，有数据“I”的报警，反应曲线与正常曲线差异很大，出现了底物耗尽。

反应曲线分析：

ALT（谷丙转氨酶），设定的测光区域是22-28。如图一所示的数据反应曲线，浓度值是-1U/L，结果明显异常，从图可知在17-21点，也即延迟期内，底物消耗过快，从起始吸光度约11000，在21点时，降到了200以内。但在正常的测光区域（22-28点）反而没有吸光度的变化，导致结果计算错误，不符合真实情况。应适当稀释标本重新进行测定，观察反应曲线有无其他异常。

图一 反应曲线图

何为底物耗尽

在动力学法检测的生化反应中，由于标本酶含量过高，导致反应体系中酶的底物短时间内消耗殆尽，使得之后的反应吸光度变化近乎为零，反应曲线成为一段较为平坦曲线，其斜率不符合实际情况，所得结果也不符合真实值，这种现象称为底物耗尽。

酶促反应不同于一般催化反应，反应不是瞬时完成的，而是经过一个进程。酶分子要和底物分子结合，然后才能催化底物反应。

反应开始时，酶与底物分子结合很少，反应速度很慢，底物或产物的变化量与时间不成正比，这一时期称为延迟期。延迟期的时间一般为数秒钟到数分钟，这也就是为什么所有厂家的酶类项目，在参数设置时，测光点都会选择在启动反应试剂（双试剂时，为试剂二）加入一段时间之后；随着时间的推移，酶与底物分子结合增多，反应速度加快，底物或产物的变化量与时间成正比，这一时期称为线性期（也称零级反应期）。试剂厂家，按照其试剂的特性，确定线性期测光点，极为重要；随着底物的减少和产物的增加，逆反应增强，反应速度减慢，偏离线性期。（图二）

底物浓度对酶促反应速度有很大的影响，只有当底物浓度足够大时，酶促反应速度才能保持恒定，此时的酶促反应速度与酶活性才有线性关系，因此，只有在零级反应期，单位时间内吸光度（A）变化值才与酶活性成正比。（图三）

酶促反应进程曲线如下图二、图三所示：

图二 

  酶促反应时间进程曲线

图三

单试剂测定体系酶促反应进程曲线

速率法反应曲线与底物耗尽

速率法，连续测定酶反应过程中某一反应产物的浓度随时间变化的多点数据（图四&图五）,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法。通常用于酶类项目，例如：ALT、AST、LDH等。

图四  单试剂速率A法

图五双试剂速率A法

酶类项目检测的试剂盒，不同厂家提供的试剂线性范围与试剂的质量有直接关系。但绝大部分试剂盒所含的底物浓度在一般情况下是足够大的，可以满足绝大多数临床标本的实际检测需要。但当人体肝脏、心脏等损伤特别严重时，ALT、AST、CK等酶的释放会使得血中的浓度大幅度上升，样本中酶的含量远远大于试剂检测的线性范围，也就是零级反应期非常短，不能完成正常的速率法检测，此时的检测是无效的，不准确的。如图六，反应曲线示意图中红色虚线，底物耗尽样本的反应曲线。

图六 反应曲线示意图

当发生底物耗尽时，日立生化分析仪会有对应的数据报警符号（Limt0/Limt1/Limt2，在测定结果后面显示分别对应的”I”、”J”、”K”），提示数据异常。

酶活性检测过程中底物耗尽现象的监测和处理

上文案例中，患者ALT结果是负值，而且有既往结果，引起了检验科大夫的重视。试想，假设在测光区域有一点变化，结果不是负值，而且也没有既往结果，很有可能会将错误的结果发出去。为了防止这种现象发生，日立所有的机型都具备底物耗尽监测和报警的功能。当然，合适的参数设置极其重要，例如，对于反应过程吸光度呈升高的酶类项目，我们应该在参数设置画面设置合理的高限值（Abs.limit）；相反，对于吸光度呈下降趋势的项目，应该设置合理的低限值（Abs.limit）。同时，我们在选择试剂时，一定要注意试剂本身的质量，认真评估试剂的线性范围。

对于底物耗尽的监测需要合理的参数设置，以及仪器的报警提醒。相比而言，底物耗尽的处理却是很简单的，只需要用生理盐水（或去离子水）进行适当的稀释，然后乘以相应稀释倍数即可。值得一提的是，稀释并不是无限制的，稀释倍数越大引起的误差可能就越大，需要对试剂最大稀释倍数进行有效评估。

（笔者：权国强）

参考资料

[1] 闫家微，张启全，成松，全自动生化分析仪ALT底物耗尽现象的发现和解决。国际检验医学杂志2011年9月第32卷第14期。

[2]刘成，刘爱华，生化分析仪检测酶活性过程中底物耗尽的监测和处理。检验医学与临床2011年2月第8卷第4期。

[3]岳展伊，唐古生，杜大海，王学，李闻捷，张建荣，全自动生化分析仪监测酶活性过程中得底物耗尽的监测和处理。国际检验医学杂志2010年4月第31卷第4期。

欢迎您在下方留言板中留言，我们期待您的意见或建议，谢谢！