（文章篇）S3E4：一个LncRNA和基因互相激励的故事

题目：

Yang F, ZhangH, MeiY, WuM. Reciprocal regulation ofHIF-1α and lincRNA-p21 modulates the Warburg effect. Mol Cell. 2014 Jan 9;53(1):88-100.

杂志： Mol Cell, IF 14.0

时间：9/1/2014

研究团队：Wu Mian (吴缅)，对研究团队感兴趣的朋友可以点文末“阅读原文”。

虽然这篇文章发表时间较早，不过研究内容涉及到了LncRNA，HIF-1α，反馈回路和Warburg效应等热点，而且研究思路和方法都非常经典，所以值得我们好好学习和借鉴。

简单介绍一下背景：

Warburg Effect：TheWarburg effect is the observation that most cancer cells predominantly produce energy by a highrate of glycolysis followed by lactic acid fermentation in the cytosol, rather than by a comparatively low rateof glycolysis followed by oxidation of pyruvate in mitochondria as in most normal cells.

瓦氏效应，指OttoHeinrich Warburg所提出的理论，是指在糖酵解过程中，癌细胞偏向于走乳酸发酵途径，而非氧化磷酸化途径。

好了，我们开始看这篇文章，下面是这篇文章的机制部分：

在常氧条件下，HIF-1α与VHL结合，被VHL介导泛素化修饰并通过蛋白酶体途径降解；

在缺氧条件下，HIF-1α表达上升，而高表达的HIF-1α则促进LincRNA-P21转录，提高LincRNA-P21水平；反过来，高表达的LincRNA-P21与HIF-1a和VHL结合，从而解除VHL对HIF-1α的泛素化修饰和降解，从而上调HIF-1α蛋白丰度；从而形成HIF-1α//LincRNA-P21//HIF-1α的正反馈回路，高表达的HIF-1α激活GLUT1和LDHA，使细胞进入无氧糖酵解途径。

如果设计基金的话，题目就是：缺氧诱导的LincRNA-P21/ HIF-1α正反馈回路介导的Warburg效应在肿瘤发生中的机制研究，主要围绕LincRNA-P21展开的功能和机制研究。

如果按照基金的写作方式，这篇文章的研究目标主要包括以下5部分：

1. 确定LincRNA-P21受到缺氧诱导，而且是缺氧糖酵解过程的必要分子；（Figure1）

2. 明确LincRNA-P21参与缺氧糖酵解是HIF-1α依赖的；（Figure 2）

3. 阐明LincRNA-P21通过与VHL和HIF-1α结合，阻断了VHL对HIF-1α的泛素化降解机制；（Figure 3，4）

4. 揭示HIF-1α转录激活LincRNA-P21的过程；（Figure 5）

5. 验证LincRNA-P21作为癌基因的促肿瘤的体内外功能。（Figure6）

这篇文章我们重点说LincRNA-P21与 HIF-1α之间的正反馈回路调节作用，也就是以上五部分中的第2，3，4四部分，下面我们挑重点解读。

1.确定LincRNA-P21受到缺氧诱导，而且是缺氧糖酵解过程的必要分子；（Figure1）

我们知道这篇文章的重点是围绕LincRNA-P21展开的，那么这篇文章是如何确定LincRNA-P21作为研究对象的呢？我们在前面（策略篇）千里挑一：挑选差异基因的七点策略中，分享了从高通量数据出发挑选分子的七点策略，我们看下这篇的策略。

• 首先作者感兴趣的是缺氧诱导的LncRNA分子，于是作者通过生物信息学预测到了包含HRE（HIF-1a responseelement，HIF-1α应答元件）的6条lncRNA，除了LincRNA-P21外，还有MALAT1等明星分子；

• 作者发现只有LincRNA-P21表达受到缺氧诱导，而且是时间和浓度梯度相关的；

• 然后构建了沉默LincRNA-P21表达的shRNA，并发现沉默表达的LincRNA-P21逆转了缺氧糖酵解过程。

第一部分比较简单，主要说下作者挑LncRNA分子的思路，如果换成我们是不是又要缺氧处理细胞，然后去做测序了？

2. 明确LincRNA-P21参与缺氧糖酵解是HIF-1α依赖的；

为了说明HIF-1α在LincRNA-P21参与缺氧糖酵解中的关键作用，作者完成了以下实验：

• 由于HIF-1α通过靶基因的HRE发挥功能，通过荧光素酶报告系统实验证明缺氧增加了HRE（WT）而非HRE（WT）的活性，而该活性被LincRNA-P21敲减所逆转；

• HIF-1α的抑制剂地高辛或shRNA阻断了LincRNA-P21对HRE（WT）活性的作用；

• 沉默LincRNA-P21下调了HIF-1α的表达，而LincRNA-P21过表达则回复HIF-1α表达；

• 外源加入的HIF-1α逆转了由LincRNA-P21沉默表达导致的糖酵解结果；

在这一部分，作者还发现LincRNA-P21沉默消除了缺氧导致的HIF-1α表达，为下面HIF-1α对LincRNA-P21的调控做了铺垫。

3. 阐明LincRNA-P21通过与VHL和HIF-1α结合，阻断了VHL对HIF-1α的泛素化降解机制；

这里分figure 3和4两个图来展示，Figure 3说的是LincRNA-P21提高了HIF-1α的蛋白稳定性。

• RT-PCR发现LincRNA-P21沉默不影响HIF-1α mRNA水平，排除LincRNA-P21对HIF-1α RNA水平的影响；

• LincRNA-P21沉默降低了HIF-1α蛋白的半衰期，而蛋白酶抑制剂MG132处理逆转该结果；

• E3泛素酶VHL沉默阻断了LincRNA-P21沉默导致的HIF-1α表达下调，由于VHL结合的是hyp564 HIF-1α（564位脯氨酸羟基化修饰的HIF-1α），而LincRNA-P21沉默下调了hyp564 HIF-1α表达，并被MG132回复；

• LincRNA-P21沉默提高了HIF-1α的泛素化修饰水平，并增加了HIF-1a-VHL、hyp465-HIF-1a-VHL的结合；

这里作者从HIF-1α的RNA水平着手，首先排除了LincRNA-P21对RNA水平的影响；然后从蛋白的降解着手，并选取了VHL介导的泛素化酶解作为主题，设计一系列实验层层深入，最后明确了LincRNA-P21通过解除hyp465-HIF-1a/VHL的结合抑制HIF-1a蛋白降解。

Figure 4说的是LincRNA-P21与HIF-1α和VHL的相互作用。

• 从HIF-1α和VHL蛋白出发，通过对HIF-1α和VHL进行免疫沉淀 RT PCR，确定与HIF-1α、VHL的结合的是LincRNA-P21；

• 从LincRNA-P21出发，通过RNA-Pulldown WB，确定与LincRNA-P21结合的是HIF-1α、VHL；

• 通过（蛋白和RNA）截断实验，进一步明确HIF-1α和VHL蛋白与LincRNA-P21结合的序列。

4. 揭示LincRNA-P21是HIF-1α转录激活的直接靶点；

• HIF-1α表达沉默下调了LincRNA-P21的表达，LincRNA-P21表达水平与HIF-1α呈剂量正相关，加入HIF-1α表达诱导剂CoCl2/DMOG，LincRNA-P21表达上升；

• 染色质免疫共沉淀CHIP-PCR实验检测HIF-1α对LincRNA-P21中两个HRE序列的直接结合；

• 荧光素酶报告基因实验验证HRE序列在HIF-1α转录激活LincRNA-P21中的关键作用。

第3和第4部分证明蛋白与RNA结合、转录因子和DNA结合的几个实验非常经典，以后我们还会分享一篇文章详细介绍研究RNA—蛋白—DNA相互作用的思路和方法。

5. 验证LincRNA-P21作为癌基因的体内外功能。

这一部分实验比较主要说明的是LincRNA-P21的癌基因功能，首先作者发现人来源的LincRNA-P21与小鼠来源的LincRNA-P21不同，没有在阿霉素诱导细胞凋亡过程中发挥功能；然后通过裸鼠荷瘤实验发现LincRNA-P21沉默表达的细胞瘤快显著小于对照组。

最后，总结一下LincRNA-P21发挥功能的机制图。

HIF-1α//LincRNA-P21//HIF-1α正反馈回路

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好了，这篇文章就到这里，其实文章里面还有很多值得挖掘的东西，比如实验的严谨性，下次有机会我们再说吧。