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作者：蚍蜉玉 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 miRNA是由Victor Ambros,Gary Ruvkun两位科学家发现，主要参与转录后调控。关于小RNA的研究已经越来越火热，Pubmed记录2007年只有898篇文章，而10年后2017年就已经有了12891篇文章。 小RNA的研究范围不再仅仅是肿瘤的mark，今日小编科普一下小RNA与明星分子mTOR信号通路之间的套路，它们首次搭配会产生什么样的火花。 《miR-181a Participates in Contextual Fear Memory Formation Via Activating mTOR Signaling Pathway》（回复171009可下载，一周有效）miR-181a 参与到恐惧记忆的形成是通过激活mTOR信号途径。 根据题目信息，回顾一下以往microRNA的套路，参与转录后调控因此必须要有靶mRNA与其结合；mTOR的信号通道途径套路，必须是与mTOR信号蛋白相关。 那就跟着小编快来看看作者是如何一步一步验证的吧！ 1 小鼠恐惧条件反射训练1h后，观察海马中miR-181a 的表达水平升高 第一：检测恐惧反射记忆是否与miR-181a的表达水平相关 恐惧条件反射训练（CFC）分别是1h和6h后，qPCR技术检测海马中miR-181a 的表达水平。结果发现海马中miR-181a 的表达水平在恐惧条件反射训练1h时比6h高，表明miR-181a 可能与海马内的恐惧记忆相关。 第二：课题组为了检测出恐惧反射记忆训练诱导miR-181a的变化对恐惧记忆的学习是特异的，因此在CFC训练或者是电休克的时候也检测了miR-181a的水平变化。 结果表明不管是电休克或者CFC训练都不能上调miR-181a的表达水平1b。表明miR-181a的变化对海马记忆的学习是特异性的。 第三，更有趣的是，杏仁核是脑内记忆形成区，但是miR-181a的水平却在CFC训练后没有显著的变化。 综上所述，CFC训练能够提高小鼠海马中miR-181a的表达水平。 2 在海马中调控miR-181a的表达水平时会不会影响恐惧记忆的巩固 第一：课题组在大鼠海马中的DG区域内注射miR-181a 抑制剂，敲减miR-181a ，并且用生物素标记， 1周后，qPCR结果显示 miR-181a水平下降了60%。；同时，在大鼠DG区域内注射miR-181a 过表达慢病毒，用GFP标记，4周后，qPCR结果显示 miR-181a水平升高了96%。 综上所述：miR-181a 抑制剂抑制以后显著降低了海马内miR-181a的表达水平；miR-181a 过表达慢病毒注射以后显著增加了海马内miR-181a 的表达水平。 第二：接下来课题组检测miR-181a敲除后对海马依赖性记忆的影响。课题组分为scramble组和miR-181a拮抗组进行检测。结果发现0.7MA电休克后两组对CFC训练都没有效果。表明miR-181a 敲除对恐惧记忆获取没有影响。 第三：我们又检测了CFC训练1后短期记忆 （STM）和24h长期记忆（LTM 1）的水平。结果发现短期记忆中0.7MA电休克后在两组冻结时间没有明显的差距；LTM实验中，antagomir组冰冻时间相对scramble 组较短，表明阻止miR-181a损害了恐惧记忆的巩固。 美腻腻的分割线。。。。。。。以上已经发现了miR-181a对于恐惧记忆的形成和巩固有重要的作用的现象，那接下来就是要探索机制了。 3 PRKAA1和 REDD1是miR-181a的靶向目标 课题组的目标是确定miR-181a调节的靶向目标与海马记忆相关。 通过Targetscan,miR-22, miRDB, microcosm计算方法，预测与 miR-181a相结合的mRNAs的3′UTR位点区：PRKAA1和 REDD1是mTOR的信号通路蛋白能够被miR-181a所调节。 第一：用荧光素酶报告基因检测PRKAA1和 REDD1的3′UTR区与miR-181a相结合。在293T细胞中共转PRKAA1和 REDD1 3′UTR荧光质粒和miR-181a质粒，荧光素酶调节的荧光素显著下降；但是PRKAA1和 REDD13′UTR区突变后，其荧光素酶没有变化。 这些结果显示miR-181a与PRKAA1和 REDD13′UTR区结合后抑制了荧光活性；当用antagomirs抑制剂抑制 miR-181a的功能时，荧光活性恢复正常。这些结果表明miR-181a与PRKAA1和REDD1相结合。 4 小鼠经过CFC训练后，并且在miR-181a的诱导下PRKAA1和REDD1的蛋白水平下降 首先观察CFC训练是否与PRKAA1和REDD1蛋白水平相关。 第一：CFC训练小鼠4h后，PRKAA1和REDD1的蛋白水平下降; 第二：经过CFC训练后，是否对mTOR磷酸影响。结果发现CFC训练0,4h后，mTOR磷酸化水平增高。 其次，根据以上这些结果，作者提出疑问是否PRKAA1和REDD1的蛋白水平变化以及mTOR磷酸化水平的变化与miR-181a相关。 第一：作者将小鼠分为四组HC + veh, HC + anta, CFC + veh, and CFC + anta，结果发现：
这些结果表明CFC训练后PRKAA1和REDD1的蛋白水平的下降时由miR-181a所调节的。 第二：已经发现PRKAA1和REDD1的蛋白水平的下降是由miR-181a所调节，那么需要检测 mTOR的活性变化， 结果发现：
综上所述，miR-181a能够减少PRKAA1和REDD1的蛋白水平和增加 mTOR活性水平的变化。 5 miR-181a 能够在经过CFC训练后影响转录相关蛋白p70-S6k和4EBP1 之前的研究表明，蛋白合成对记忆的巩固是至关重要的。因为 mTOR信号通道对蛋白的翻译和合成非常重要，课题组探索是否 miR-181a能够调节蛋白翻译来参与在CFC训练后巩固记忆。 第一：课题组选择了mTOR下游的目标蛋白p70-S6k 和4EBP1，来探索是否增加mTOR的活性能够调节蛋白翻译。结果发现： HC+anta组与HC + veh组相比p70-S6k 和4EBP1蛋白活性显著下降，揭示出阻断miR-181a能够下调p70-S6k 和4EBP1蛋白水平变化。
第二：小鼠在经过CFC训练以后CFC + veh组比HC + veh组的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性较高；然而，注射antagomir后， CFC + anta组的 p70-S6k 和4EBP1蛋白活性在cfc训练4h以后下降。 综上所述，CFC训练以后miR-181a能够促进p70-S6k 和4EBP1蛋白活性，从而增加mTOR 信号通道蛋白翻译。
6 miR-181a 调控的恐惧记忆巩固依赖于PRKAA1 和REDD1 为了这个目的，首先检测是否 PRKAA1 和REDD1蛋白是海马依赖性记忆的功能蛋白。所以使用了PRKAA1蛋白的激活剂 AICAR和抑制剂 Compound 9。构建了REDD1干扰的慢病毒质粒 siREDD1和过表达REDD1的质粒并且都带有GFP荧光。 课题组实验分为4组 GFP + veh, GFP + AICAR,REDD1-OE + veh, 和REDD1-OE + AICAR。注射REDD1-OE 和AICAR组的小鼠在经过CFC训练后，与注射GFP + veh组小鼠经过CFC训练1h后电休克冻结时间相同。表明PRKAA1和REDD1蛋白对恐惧记忆获得和短期记忆训练没有相关性。
为此课题组延长了训练时间到24h，结果发现注射REDD1-OE, AICAR, 和REDD1-OE + AICAR组与载体组相比有较低的冻结时间。表明PRKAA1和REDD1蛋白水平的升高能够损害了恐惧记忆的巩固。同样的注射 siREDD1 和 C9后，有同样的效果。
但是，进行长期记忆训练24h后，注射siREDD1 和 C9以及 siREDD1 + C9，电休克（0.4MA）后显著提升了冻结时间。表明阻止了PRKAA1和REDD1蛋白的表达增强恐惧记忆的巩固。 为了最终的目的，课题组继续探讨 miR-181a过表达后能够增加恐惧记忆的整合。
综上所述， miR-181a对于海马恐惧记忆的整合依赖于PRKAA1和REDD1蛋白。
7 miR-181a对于海马恐惧记忆的整合依赖于mTOR信号通道 课题组分了四组Scr + veh, siREDD1 + C9, Scr+rapamycin和siREDD1 + C9+rapamycin检测电休克后的冻结时间，结果发现：
综上所述，PRKAA1和REDD1 蛋白通过抑制mTOR活性参与入恐惧记忆的整合。
181a-OE+rapamycin 组呈现出显著的冻结时间下降（与载体对照组相比），但是与 GFP+rapamycin组的相同。表明抑制mTOR的活性能够去除miR-181a 增高诱导的恐惧记忆整合程度增强。 综上所述，miR-181a对于海马恐惧记忆的整合依赖于mTOR信号通道。
以上，便是miR-181a与mTOR信号通道擦出的火花，书写了两条重要的线路，有没有让你学习的地方呢？
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