【原】从PNAS中找到自噬凋亡的研究逻辑

解螺旋 2020-08-27

展开全文

之前我们练手的两篇，分数较低，因此结构和论证都比较简单。今天就来提高些难度，看一篇PNAS的文章，提高下水准。

今天我们来继续八一八科研论文是怎么炼成的，学习酸菜《三十六策》，老谈《二十四型》还有一堆套路课、文献一点通等课程还能为你的未来提供捷径还能加分哦！

废话不多说，上菜！

之前我们练手的两篇，分数较低，因此结构和论证都比较简单。今天就来提高些难度，看一篇PNAS的文章。一篇医学研究性论文的内容往往蕴含着以下四个要素：疾病、表型、分子和机制。我们就以“microRNA-378 promotes autophagy and inhibits apoptosis in skeletal muscle”为例，来试着快速提取文章关键信息，进行总结提升。

文章的四要素基本在题目中就有所体现，或再结合摘要，即可反向推导出文章学术思想的灵魂所在——科学假设，进而判断出该文章是否与自己所研究的领域相挂钩。

首先，我们要读题，分析四要素，也就是疾病，表型，分子和机制。

从标题与摘要我们可以获得的要素有：研究的疾病是肌肉营养不良，研究的主变量是microRNA-378，表型是自噬与凋亡，信号通路是mTOR/ULK1信号通路等。

因此，我们得出的科学假设是在肌肉营养不良相关疾病中，miR-378可通过mTOR/ULK1信号通路增强自噬，通过Forkhead box class O (FoxO)靶向phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)来维持自噬，靶向Caspase 9来抑制凋亡。

然后，经过酸菜36策的学习，脑海中就有这样一个逻辑框架，动物、组织、细胞、分子四维结构。有我们上述得到的科学假设，我们在这个四维结构中可以推出，作者需要证明miRNA-378在组织表达中有差异，在细胞和动物水平中有自噬与凋亡表型相关分子或功能实验的相应变化，在机制水平需要证明信号通路的直接或间接机制，在临床水平可以做biomarker和自噬、凋亡表型的相关性分析。

下面，来看文中的Figure。

首先，我们看Figure1，在Figure1是通过动物与组织层面的检测来说明在小鼠敲除miR-378后，可引起骨骼肌的异常。

A图是用qPCR法检测miR-378在C57BL/6J 鼠的不同组织包括脑、附睾的脂肪、心脏、肾、肝、肺、骨骼肌、胰腺、脾脏和睾丸的表达情况，可见miR-378在心脏、肾、骨骼肌表达较高；

B图表示用qPCR检测喂食和禁食小鼠的肌肉中miR-378水平；

C图表示正常与miR-378敲除组小鼠骨骼肌重量与体重的情况，miR-378敲除组小鼠肌肉重量相较正常组降低，差异有统计学意义。图中SOL表示比目鱼肌，GAS表示腓肠肌，TA表示胫骨前肌；

D图表示通过免疫荧光的方法，显示正常与miR-378敲除组小鼠小窝蛋白（caveolin）不同，右侧统计图GAS腓肠肌可见miR-378敲除组小鼠肌纤维变细；

E图表明正常与miR-378敲除组小鼠最大跑步机跑步距离，miR-378敲除组小鼠最大跑步距离减少，可见miR-378敲除导致小鼠跑步性能减弱；

F图为电镜图像，自噬体（箭头处）和miR-378敲除组小鼠腓肠肌的线粒体异常；

G，H图表示qPCR检测自噬相关基因LC3b, ATG12, ATG4b, Garbarapl 1, BNIP3，Beclin和VPS34表明miR-378敲除组小鼠中该类分子表达减弱。通过WB检测LC3B I,LC3B II表达情况。可见miR-378敲除组小鼠减弱；

I图在H图的基础上，进一步通过正常与miR-378敲除组小鼠分别分为喂食和禁食小鼠，进一步观察LC3B I,LC3B II表达情况，来反映自噬情况；

J图表示WB检测正常与miR-378敲除组小鼠腓肠肌的PARP与cleaved PARP表达情况。文章中提到的glucose-free DMEM (No Glu)、amino acid-free Krebs-Ringer Buffer (KRB)是两种常用的无糖与无氨基酸培养基。

自噬的过程、相关蛋白表达及检测方法

自噬过程分为三阶段： 双层分隔膜的形成阶段（启动阶段）形成自噬前体（Pre-autophagosome）、自噬体的形成阶段完全自噬体（autophagosome）、自噬溶酶体的形成与裂解阶段最终形成自噬溶酶体（autolysosome），并降解细胞质或细胞器成分。

LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成。未发生自噬时，细胞合成的LC3B经过加工，成为胞质可溶性的LC3B I，常规表达。当自噬发生时，LC3B I被Atg7活化，经泛素样加工修饰过程，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3B II(lipidated LC3 (LC3-II))。LC3B II结合并始终位于胞内自噬体膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。

ATG4B (Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase)是一种蛋白编码基因。其相关通路有自噬通路，与该基因相关的基因本体注释【Gene Ontology (GO)】包括肽酶活性和半胱氨酸型肽酶活性、

BNIP3 (BCL2 Interacting Protein 3)是一种蛋白编码基因。与BNIP3相关的疾病包括遗传性平滑肌瘤病、肾癌和肾上腺嗜铬细胞瘤。其相关通路有军团菌病和FoxO信号通路。与该基因相关的基因本体 (GO) 注释包括蛋白均二聚活性和蛋白异二聚活性。该基因的一个重要副产物是BNIP3L。

在自噬成核过程中，ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3，并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。ATG12 与 ATG15 可能参与了自噬溶酶体的裂解。

Beclin 1编码蛋白是介导囊泡转运过程的磷脂酰肌醇-3-激酶复合体(PI3K)的组成部分，在多种细胞过程中发挥作用，包括肿瘤发生、神经变性和细胞凋亡，可选择的剪接导致多种转录变体。

p62主要参与自噬蛋白降解过程。p62能够结合泛素化蛋白，并与LC3形成复合物，从而使蛋白质转入自噬溶酶体内被降解。当自噬发生时，随着蛋白质的不断降解，p62水平也会逐渐降低；而自噬缺陷时，会出现p62聚集。p62是检测自噬活性的一个标志蛋白，其表达水平与自噬活性成负相关。

（引用：genecards网站，老谈《二十四型第五型自噬》）

然后我们再看Figure2，Figure 2在组织水平说明miR-378促进肌肉细胞的自噬。

A图表示在无糖及无氨基酸情况下，C2C12肌管的miR-378表达升高；

B图表明在无糖及无氨基酸情况下，含miR-378的在无糖及无氨基酸情况下相较对照组发现LC3B II表达增高，表明miR-378可促进自噬；

C、F图WB结果说明过表达mi-378可促进LC3BII表达,p62表达减少，抑制miRNA可减少LC3B II表达,p62表达增加；

D图通过免疫荧光更直观的表现出miR-378可促进成肌细胞中自噬相关蛋白LC3 表达；

E图表示Ad- mCherry - GFP-LC3感染的C2C12成肌细胞中，LC3的免疫荧光图像，其中转染miR-378者表达较抑制miR378组明显增强；

H图通过Baf A1与氯喹作用下进行比较LC3表达情况，进一步说明miR-378促进自噬体形成，增强自噬通量。

3-MA，雷帕霉素，Baf A1 与 CQ在自噬中的作用

氯喹（CQ）可通过破坏溶酶体的结构和功能而抑制自噬的作用，导致自噬溶酶体聚集，可以使自噬相关蛋白LC3B II与p62等降解减少，抑制细胞自噬发生。

雷帕霉素在真菌和哺乳动物细胞中可以抑制mTOR的活性，有助于Atg13去磷酸化，活化Atg1而诱导自噬发生。

3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine ,3-MA）可以通过抑制Class III phosphatidylinsitol3-kinase,class III PI3K)从而抑制自噬体的形成。

巴弗洛霉素A1[bafilomycin A1 (Baf A1)]可酸化自噬体内囊泡物质的H+-ATP 酶质子泵抑制剂, 而 H+-ATP 酶是溶酶体发育成熟的关键酶, 巴弗洛霉素 A1抑制囊泡酸化进而抑制自噬体后期形成。

接下来我们看Figure 3，该图主要是说明PDK1可调节miR-378对骨骼肌自噬的影响。

A图是miR- 378和PDK1-3′UTR从不同的物种进行序列比对；

B图通过荧光素酶分析显示，转染miR-378与转染抗miR-378者对荧光素酶的表达均有影响，即从机制的水平说明miR-378与PDK1可直接相互作用；

C、D图qPCR、WB结果表明，正向操作表明miR-378可以抑制PDK1，反之可促进PDK1表达；

E、F图在qPCR,WB检测小鼠身上敲除miR-378后PDK1 mRNA及蛋白表达升高，反向证明miR-378可抑制PDK1表达；

G图通过control,miR-378,miR-378+PDK1三组来做了一个Rescue说明，根据“反正正”的原理进行设计，说明miR-378是通过抑制PDK1来促进自噬；

H图通过免疫荧光的方式，按照control,miR-378,miR-PDK1分组，在Ad-mCherry-GFP-LC3–infected C2C12 成肌细胞中，进一步说明根据荧光强弱的表达变化，更直观显示miR-378是通过抑制PDK1来促进自噬；

I图通过Control,Ad-378,PDK1,Ad-378+PDK1四组进行WB进行检测，Control，Ad-378相比p-AKt,p-mTOR，p-ULK1表达降低，说明miR-378可通过mTOR/ULK1通路促进自噬，PDK1,p-FoxO,p62表达减弱，LC3B II表达增强，FoxO1表达增强，说明miR-378可通过FoxO1来维持自噬，并可抑制PDK1的表达。

Control,Ad-378，Ad-378+PDK1根据”反正正“原理进行Rescue来说明miR-378可靶向抑制PDK1来发挥促进自噬的作用；

J、K图根据Rescue口诀“反反反”，按照Ant-ctrl,Ant-378,Ant-378+siPDK1来分组，通过免疫荧光与WB说明miR-378是通过抑制PDK1来经由mTOR/UKL1通路促进自噬。

接下来我们看Figure 4,该图主要从机制水平来说明miR-378可靶向Caspase 9（CASP9）的3'UTR区来发挥作用。

A图miR- 378和Caspase 9-3′UTR从不同的物种进行序列比对；

B图通过荧光素酶分析显示，转染miR-378与转染抗miR-378者对荧光素酶的表达均有影响，即从机制的水平说明miR-378与Caspase 9可直接相互作用；

C、D、E图qPCR、WB、免疫荧光结果表明，正向操作表明miR-378可以抑制Caspase 9，反之可促进Caspase 9表达；

F图通过正反操作miR-378的表达观察PARP分子表达改变；

G-I图说明Caspase 9的mRNA表达变化。

通过正常组与敲除miR-378小鼠进行比较，G，H图通过qPCR与WB说明敲除miR-378可促进Caspase 9的mRNA表达升高，cleaved-Caspase 9表达升高，I图说明敲除miR-378后Caspase9活性升高。

J图WB说明敲除miR-378对 cleaved CASP表达升高；

K图通过敲除miR-378的KO组，KO+z-VAD组，根据结果KO+z-VAD组最大运动距离增加，说明抑制凋亡可提升运动能力。z-VAD全称是z-VAD-FMK,一种凋亡的抑制剂；

L图通过KO组，KO+z-VAD组发现一个现象，z-VAD可减少cleaved CASP3与 cleaved PARP的表达，但是可促进LC3B II表达增高、p62表达降低，说明其可促进自噬。返回原文阅读结果，发现查阅文献发现CASP3能够抑制自噬，即减少 cleaved Beclin 1 (BECN1)表达，促进凋亡，其在附件中也有做了KO+z-VAD组小鼠的C2C12的肌管和腓肠肌中cleaved BECN1表达降低。

接下来我们来看Figure 5,这张图在组织水平进行说明过表达miR-378可促进骨骼肌自噬和抑制凋亡。

A图用PCR说明造模型成功，agomiR-378处理后的小鼠在腓肠肌与胫骨前肌中miR-378表达增高；

B图用control、agomir-378小鼠对比，PDK1、CASP9在agomir-378处理组小鼠的腓肠肌中表达减少；

C，D，E图WB结果显示agomir-378小鼠的腓肠肌中PDK1、凋亡表型相关蛋白Caspase 9,Cleaved Caspase 9,CASP3,Cleaved CASP3,PARP,Cleaved-PARP蛋白表达降低，自噬表型相关蛋白LC3B II表达升高，说明过表达miR-378可促进自噬，减少凋亡；

F图通过自噬相关蛋白LC3b, ATG12, BNIP3, BNIP3l, Cathepsin L, Atrogin 1, VPS34, Beclin在过表达miR-378的小鼠腓肠肌较对照组升高说明miR-378可促进自噬；

G图表明无论喂食或饥饿状态下miR-378均可促进LC3B蛋白表达，降低p62蛋白表达。

最后一张Figure 6,作者用一张关系图来表示本文涉及的miRNA与相关靶蛋白调控关系。